1. 凝膠層析的基本原理：

凝膠層析（Gel Chromatography）是利用凝膠層析介質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的一種方法。其基本原理是含有不同尺寸大小的分子進(jìn)入層析柱后，較大的分子不能通過孔道擴(kuò)散進(jìn)入凝膠珠體內(nèi)部，而與流動相一起流出層析柱；較小的分子可通過部分孔道，更小的分子可通過任意孔道擴(kuò)散進(jìn)入珠體內(nèi)部。這種顆粒內(nèi)部擴(kuò)散的結(jié)果，使小分子向柱下的移動減慢，從而樣品根據(jù)分子大小的不同依次按一定順序從柱內(nèi)流出，一般是大分子先流出來，小分子后流出來，從而達(dá)到分離的目的。凝膠層析介質(zhì)像分子篩一樣，將大小不同的分子進(jìn)行分離，因此，凝膠層析又叫分子篩層析或稱尺寸排阻層析。

層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質(zhì)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，流下來速度慢，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部，下來的速度快，當(dāng)混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。

2. 凝膠層析的優(yōu)點：

分離條件溫和，可在多種條件下工作。凝膠層析介質(zhì)為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)分子發(fā)生作用，分離條件溫和，蛋白質(zhì)維持原結(jié)構(gòu)，故不易變性，可保持被分離成分的理化性質(zhì)。凝膠層析可在相當(dāng)廣的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行操作，因此更適用于某些不穩(wěn)定的分子，尤其是那些對pH值、金屬離子濃度敏感的、對環(huán)境要求苛刻的生物分子的分離。為滿足蛋白質(zhì)的特殊要求，可以在多種條件下進(jìn)行分離，如在高離子強(qiáng)度、低離子強(qiáng)度，以及脲、鹽酸胍存在的環(huán)境下進(jìn)行分離。

蛋白質(zhì)回收率高。目標(biāo)蛋白質(zhì)的回收率很高，幾乎可達(dá)99%，且實驗重現(xiàn)性好。

應(yīng)用面廣泛。工作范圍廣，分離分子量的覆蓋面大，可分離相對分子質(zhì)量從幾百到數(shù)百萬的分子，尤其適用于活性大分子的分離。凝膠層析對環(huán)境的要求不嚴(yán)格，可以在低溫下操作，也可在37℃下進(jìn)行分離，還可以根據(jù)蛋白質(zhì)的需求選用多種緩沖液。

設(shè)備簡單，易于操作。凝膠層析的設(shè)備簡單，易于操作，周期短，每次分離之后介質(zhì)不需再生，故可連續(xù)使用，有的凝膠層析柱可連續(xù)應(yīng)用幾百次甚至上千次。

3. 凝膠層析的應(yīng)用：

脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過程中不易變性。

分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、多糖、核酸、激素、疫苗、生物堿等物質(zhì)的分離提純。凝膠對熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。

分子量的測定：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對分子量的對數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知物質(zhì)的分子量時，可將此樣品加在測定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗腫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。

高分子溶液的濃縮：通常將凝膠層析介質(zhì)干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質(zhì)就會進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。

凝膠層析因其條件溫和，操作簡單，蛋白質(zhì)回收率高及重現(xiàn)性好等特點，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)等方面獲得廣泛的應(yīng)用，如蛋白質(zhì)、酶、多肽、抗體及激素的分離純化，分子量測定及多聚體研究，臨床分析，熱原去除及藥物制備等，在輕工食品等領(lǐng)域也得到極為廣泛的應(yīng)用。