丙酮酸脫氫酶(PDH)試劑盒

丙酮酸脫氫酶(PDH)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）試劑盒說明書 （貨號：WS6380F 分光法 48 樣） 一、產品簡介： 丙酮酸脫氫酶（PDH，EC 1.2.4.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中， 是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，把糖酵解和三羧酸循環連 接起來。 丙酮酸脫氫酶（PDH）催化底物丙酮酸鈉生成羥*基-TPP，在電子傳遞體（PMS） 存在下，使噻唑藍（MTT）還原生成藍色產物，通過檢測該藍色產物在 566nm 處的增 加速率，即可得出 PDH 酶活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規格 保存要求 備注 試劑一 液體 50mL×1 瓶 -20℃保存 試劑二 液體 10mL×1 瓶 -20℃保存 試劑三 液體μL×1 支 -20℃保存 試劑四 粉劑 mg×2 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 每支加 1.2mL 的蒸餾水溶解。 試劑五 粉劑 mg×4 支 4℃避光保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 每支加 0.6mL 的蒸餾水溶解。 一天內用完。 試劑六 粉劑 mg×2 支 4℃避光保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 每支加 1.2mL 的蒸餾水溶解。 一周內用完。 試劑七 液體 32mL×1 瓶 4℃保存 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液 器、研缽、冰和蒸餾水。 四、丙酮酸脫氫酶（PDH）活性測定： 1、線粒體制備（提示：整個線粒體的提取過程須保持 4℃低溫環境）： ① 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細菌/細胞，加入 1mL 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻 漿，轉移至離心管后于 4℃×700g 離心 10min。 ② 棄沉淀，上清液移至另一離心管中，4℃×12000g 離心 10min。用移液器移除上清液(上 清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的酶活性（此步可選做）)，留下沉淀 （沉淀即為線粒體）。 ③ 在沉淀（線粒體）中加入200μL試劑二和2μL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或 200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），液體置于冰上用于丙酮酸脫氫酶活性測定。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進行提取，或按照細 菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進行提取。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預熱 30min 以上，調節波長至 566nm，蒸餾水調零。 ② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。 ③ 在 1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）中依次加入：本試劑盒僅供科研使用 2 五、結果計算： 1、按樣本蛋白濃度計算： 酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘還原 1 nmol 噻唑藍（MTT）定義為一個酶活性單位。 PDH 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=107.2×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計算： 酶活定義：每克組織每分鐘還原 1 nmol 噻唑藍（MTT）定義為一個酶活性單位。 PDH 活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=21.7×ΔA÷W 3、按細菌或細胞密度計算： 酶活定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘還原 1 nmol 噻唑藍（MTT）定義為一個酶活單位。 PDH 活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.044×ΔA ε---還原型 MTT 的摩爾消光系數，1.865×104 L/mol/cm； d---96 孔板光徑，0.5cm； V---加入提取液體積，0.202mL； V1---加入樣本體積，0.01 mL； V2---反應體系總體積，2×10-4 L； T---反應時間，20min； W---樣本質量，g； 500---細菌或細胞總數，500 萬； Cpr---樣本蛋白質濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 40 試劑四 40 試劑五 40 試劑六 40 試劑七 640 混勻，30℃下，10s 時于 566nm 處讀取吸光 值 A1，10min 后讀取吸光值 A2， △A=（A2-A1）測定管-（A2-A1）對照管。