Caspase-9 Activity Assay Kit (Colorimetric)
Caspase-9活性檢測試劑盒（比色法）
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
Caspase-9活性檢測試劑盒（比色法） | MX3229-20T | 20T | 880 |
Caspase-9活性檢測試劑盒（比色法） | MX3229-100T | 100T | 2950 |
產品描述
Caspases（Cysteine-requiringAspartate Proteases）是一個高度保守的半胱an酸蛋白酶家族，特異性識別底物中的天冬氨酸殘基，在介導細胞凋亡的過程中發揮著非常重要的作用。Caspases以潛在酶原的形式表達，通過自發蛋白分解機制或經其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工處理的方式被活化。人caspases可細分為三大功能組：細胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡啟動（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡執行（caspase-3，-6和-7）。
Caspase-9（Caspase 9），也稱為Mch6，ICE LAP6和Apaf3，作為caspases家族的成員之一，含CARD結構域（caspase募集結構域），是細胞凋亡信號轉導過程中比較上游的一個caspase。Caspase-9酶原分子量約47kDa，存在于胞漿內，一旦活化，轉移到線粒體。Caspase-9參與caspase活化級聯，負責凋亡執行，和切割/活化下游的caspase-3和caspase-6。當募集到Apaf1/細胞se素c復合物后，caspase-9被激活。Caspase-9的激活可通過磷酸化進行調控。
Caspase-9活性檢測試劑盒（比色法）（Caspase-9 Activity Assay Kit, Colorimetric or Caspase-9 Colorimetric Assay Kit）以偶聯上發色基團pNA的caspase-9序列特異性的多肽為底物。當底物被caspase-9剪切后，發色基團被釋放出來，進而用酶標儀或分光光度計來測定其吸光值（λ=405nm或400nm）。通過計算OD凋亡誘導組/OD陰性對照組的比值來確定凋亡誘導組caspase-9的活化程度。
本品適用于培養細胞以及新鮮組織的caspase-9活性檢測。
產品包裝
編號 | 組分名稱 | 保存方法 | 貨號（規格） | |
MX3229-20T | MX3229-100T | |||
MX3229-A | Lysis Buffer裂解緩沖液 | 2-8℃ | 5ml | 20ml |
MX3229-B | 2× Reaction Buffer 2×反應緩沖液 | 2-8℃ | 1ml | 5ml |
MX3229-C | Caspase-9 Substrate Caspase-9底物 | -20℃避光 | 100μl | 500μl |
MX3229-D | 0.1M DTT | -20℃避光 | 60μl | 250μl |
保存與運輸方法
保存：-20℃保存，1年有效。開盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-9Substrate和0.1M DTT需要避光凍存。
運輸：冰袋運輸。
注意事項
1） Caspase-9 Substrate需避光保存和使用。
2） 某些凋亡誘導劑誘導的凋亡可能通過caspase-9非依賴的方式進行，此種情況使用本品檢測的caspase-9活性無明顯變化，則，需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。
3） 起始細胞數量需達3~5×106個或新鮮組織量達50~100mg，以保證達到測定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-9的活性與細胞裂解后的蛋白含量有關，如測定的OD值偏低，可通過增加細胞數量或組織量的方法來提高蛋白量。
4） 優先選擇測定λ=405nm的吸光值；如有困難，再測定λ=400nm的吸光值。
5） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用方法
1.需要的其他試劑和材料
儀器：低溫高速離心機、酶標儀或分光光度計（100μl的比色皿）（λ=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣本）
耗材：1.5ml微量離心管、96孔酶標板（透明）或100μl的比色皿
試劑：PBS、蛋白定量試劑（比如：Bradford法蛋白濃度測定試劑盒）
2.試劑準備
2.1 Lysis Buffer（含DTT）
于實驗前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。
2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）
于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的反應工作液。
3.樣本準備
3.1 細胞裂解
a）用合適方法誘導細胞凋亡，同時設立陰性對照組（不加誘導劑），收集3~5×106個細胞。
b）PBS洗滌細胞2次（2000rpm，離心5min），盡量吸盡PBS上清。
c）往離心的沉淀細胞中加入15~200μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混勻。
d）置冰上裂解20~60min，其間渦旋振蕩3~4次，每次10s；或凍融2~3次。
e）4℃，10,000rpm離心1min。
f）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質）轉移到新的EP管內，置于冰上待用。
g）取少量上清（1~2μl），用常規方法（Bradford法）測定蛋白濃度。
3.2 組織裂解
a）取50~100mg組織置于培養皿內，用手術剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入150~200μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃勻漿器上下手動勻漿15次，注意低溫操作。
b）將組織勻漿液轉移到1.5ml預冷的離心管，10,000rpm，4℃離心5min。
c）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質）轉移到新的EP管內，置于冰上待用。
d）取少量上清（1~2μl），用常規方法（Bradford法）測定蛋白濃度。
4.Caspase-9活性檢測
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