英國Oxford 新一代超分辨熒光顯微鏡Nanoimager
英國Oxford Nanoimaging公司生產的產品超分辨熒光顯微鏡-Nanoimager 是由牛津大學Achillefs Kapanidis教授團隊經過8年時間研發而成的，是一種新型的單分子顯微鏡，也是世界上一款無需校準、無需光學平臺、超小型臺式超分辨顯微鏡。Nanoimager突破了傳統光學的衍射極限，分辨率可達20nm，是一臺大視野單分子FRET顯微鏡。Nanoimager簡單易用、設計緊湊，使用安全無害的一級激光，用戶在普通的實驗室桌面上即可獲得高分辨率的單分子熒光圖像 。適用于單分子示蹤、活細胞成像、蛋白互作、3D成像等研究。
Nanoimager技術特征
超分辨率成像
♦ 支持同時雙色成像和順序四色成像
♦ 高能量帶來高精度
♦ 三維成像
♦ 隨機光學重建顯微技術 (dSTORM)和光激活定位顯微技術 (PALM)
√ 無需光學平臺
√ 使用前無需校準
√ 操作簡單方便
√ 便攜式，體積小
√ 普通實驗桌即可安置
√ 采用1級激光，使用安全
Nanoimager顯微鏡設計
♦ Nanoimager具有和傳統顯微鏡不同的特殊設計。傳統顯微鏡需要集成單分子檢測功能的配件，同時也會帶來配件的限制性，而Nanoimager是專門為單分子超分辨成像而設計，為了達到更高的效率而移除了多余的成像元件；
♦ 配置更加安全的一級激光,Nanoimager可在任何辦公室、實驗室和教室使用。相對于放置于暗室的大型顯微鏡,Nanoimager更加方便用戶的使用；
♦ Nanoimager的顯微鏡單位面積小于A4紙；配套的激光器通過光纖連接至顯微鏡；
♦ 與定制的顯微鏡和傳統的顯微鏡設計不同， Nanoimager始終保持校準狀態。樣品準備好后可以直接成像，無需花費時間進行調試和校正。
♦ Nanoimager的封閉式系統能夠防止偏移發生并阻止灰塵和其他污染物進入，可以一直保持在正常工作狀態。作為一款臺式機， Nanoimager不需要傳統顯微鏡昂貴的配套設施，無需額外配置溫控房間、光學平臺、激光室或暗室。
Nanoimager技術原理
Nanoimager采用PALM/dSTORM技術，利用單分子定位算法并結合光學系統艾里斑的形狀，以超高精度（納米量級）獲得熒光分子的中心位置，然后用CCD將其信號進行采集轉化最終得到分辨率為20nm的超分辨圖像。
成像模式
相對于普通的Epifluorescence(EPI)/模式，Nanoimager有total internal reflection fluorescence (TIRF)/ highly inclined and laminated optical sheet (HILO)兩種模式可自由切換。
EPI：激發較厚的樣品（＞10um），信號噪聲強，即傳統模式。
TRIF：激發薄層樣品（＜200nm），信號噪聲弱，適用于膜表面成像。
HILO：激發樣品厚度（＜10um），信號噪聲較弱，適用于大部分成像。
應用領域
應用案例
1、單分子FRET
Nanoimager是一臺用于大視野單分子熒光共振能量轉移(smFRET)的商業化儀器。 FRET是一種兩個熒光分子間非輻射性的能量轉移方式，反映兩者的分子間距。 FRET一般在2 – 10 nm的間距發生。 smFRET研究中，作為供體的熒光分子由激光激發，將能量轉移至臨近的受體熒光分子。被激發的受體將能量以熒光形式發散。供體與受體可以連接至同一個或者不同的分子。
smFRET可以用于測量核酸或者單個蛋白分子的分子內距離，也可以用于研究蛋白亞基間的相互作用；還可應用于研究藥物對于酶結合位點的構象動力學的作用，或是神經退行性疾病中蛋白的聚集。 smFRET可以用于在單分子層面推到結合常數、反應途徑與停滯時間而不受總體平均值干擾。
Nanoimager適用于smFRET的關鍵功能包括：同時雙色成像；單分子散射光強度和總體平均的實時分析；視野中數千個單分子的高通量成像，以及用交替熒光激發 (ALEX) smFRET的功能來定量化學計量與FRET效率。圖4是smFRET用于研究單個DNA霍利迪交叉的動力學。
2、單分子示蹤
Nanoimager可以在兩個通道同時示蹤細胞或者純化物樣品中的單分子 (圖5)，并計算擴散系數。細胞中分子的擴散系數可以被示蹤，如酶或蛋白可以通過藥物和抗生素的反應來示蹤。低擴散率可以表示標記分子與另一分子或結構的相互作用或相結合。同時示蹤兩種標記了不同熒光分子的分子可以確定兩者動態相互作用的水平。
Nanoimager可以直接反映純化樣品中熒光粒子的擴散率和預估大小，具有敏感性 (單熒光分子級別) 和特異性 (雙色標記可以顯著降低檢測雜質的可能性)。
3、使用Nanoimager成像—更大的視野
Nanoimager的每個成像通道均有50 µm x 80 µm的大視野，而其他大部分單分子顯微設備只有20µm x 20 µm的視野。視野中照明均勻，可以實現單分子或細胞的高通量成像并快速收集數據。
下圖顯示了以10倍于其他技術的速度對突變的大腸桿菌細胞的不同表型進行成像。為了獲得不同表型的可靠的結果，需要對大量細胞進行比較。使用具有大視野，能夠自動對焦和自動獲取數據的Nanoimager可以顯著加快整個實驗速度和通量。將大視野與超分辨成像結合是Nanoimager的優勢。
