所有G蛋白偶聯受體（GPCR）在通過配體結合后，都會通過一條共同途徑迅速發生脫敏作用。 β-arrestin（一種細胞質蛋白）與受體的結合使GPCR信號失活，并啟動了受體向細胞內的易位，在此細胞中配體被去除，受體被循環回到細胞膜。通過將熒光標記（例如GFP）附著到β-arrestin，可以檢測受體arrestin復合物的位置。由于脫敏僅發生在受體上，因此檢測β-arrestin的易位和隨后的受體再循環提供了檢測GPCR靶標可靠方法。蛋白質易位GPCR信號檢測試劑盒提供了功能強大的功能分析，可通過熒光成像篩選目標化合物針對已知或孤立GPCR靶標的活性。靶向GPCR的誘導熒光向細胞膜和內吞囊泡的移位。百螢生物為您提供優質的蛋白質易位GPCR信號檢測試劑盒。
適用儀器
| 熒光顯微鏡 | |
| Ex: | FITC濾波片組 |
| Em： | FITC濾波片組 |
| 推薦孔板: | 黑色透明底板 |
樣品實驗方案
概述
準備細胞進行轉染
準備Transfectamine 5000-DNA混合物
將Transfectamine 5000-DNA混合物添加到細胞培養物中，并孵育過夜
轉染后24-30小時將轉染的細胞轉移到96孔板中，并將培養物孵育過夜
在熒光顯微鏡下分析由GPCR引起的轉運
細胞準備
細胞密度在轉染時它們將達到約60-70％的融合度。
轉染前用新鮮的生長培養基替換。
注意：例如，對于6孔板，每孔替換為2 mL培養基，對于10 cm板，則替換為6 mL培養基。
儲備溶液配制
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復凍融循環。
β-arrestin-GFPDNA儲備溶液
向小瓶β-arrestin-GFPDNA（組分A）中加入10 µL ddH2O，充分混合至終濃度為1 µg / µL。
操作步驟
1.將3 µg DNA（例如1.5 µg Beta-arrestin-GFP DNA儲備液和1.5 µg您準備的GPCR DNA）與200 µL無血清培養基混合。
2.向混合物中加入9 µL Transfectamine 5000（組分B）。
3.充分混合并在室溫下孵育20分鐘。
注意：Transfectamine 5000和DNA的比例需要針對不同的細胞系進行優化，通常，在我們的測試中，Transfectamine 5000轉染試劑（µL）與DNA（µg）的比例應為3-5 µL：1ug。
表1. 6孔板和10 cm板的樣本表
| 6孔板（每孔） | 10cm板 | |
| 新鮮培養基 | 2 mL | 6 mL |
| 質粒 | 3 µg | 10 µg |
| 無血清培養基 | 200 µL | 600 µL |
| Transfectamine 5000轉染試劑 | ~9 µL | ~30 µL |
轉染和轉運方案
1.將Transfectamine 5000 -DNA混合物添加到培養板中，并孵育過夜。
注意事項：在轉染后16小時即可檢測到重組蛋白。轉染后72?96小時可觀察到大表達水平。
2.轉染后24-30小時將轉染的細胞轉移到96孔板中，并孵育過夜。
使用FITC濾光片（Ex / Em = 488/530 nm）在熒光顯微鏡下檢測受體誘導的β-arrestin易位。
