DNA測序原理
DNA測序技術主要依據 Sanger 的雙脫氧鏈終止法。以DNA單鏈為模板,在特定條件下,用特異的引物在測序級DNA聚合酶的作用下,根據堿基互補配對原則,不斷將 4 種脫氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3'- 羥基末端并使引物鏈得到延伸。這種鏈的延伸是通過引物的 3'- 羥基和脫氧核糖核苷酸底物的 5'- 磷酸基團形成磷酸二酯鍵來完成的。如果這種反應體系中加入雙脫氧核糖核苷酸 (ddNTP) ,這種 2'3'ddNTP 的 5'- 磷酸基團是正常的 (4 種不同的熒光標記 ) ,而 3' 位置缺少羥基,因此在 DNA 聚合酶作用下,仍然可以通過 5'- 磷酸基團與引物鏈的 3'- 羥基反應摻入到引物鏈中,但是由于 ddNTP 沒有 3'- 羥基,不能繼續與下一個 5'- 磷酸基團形成磷酸二酯鍵而導致引物鏈延伸的終止。這樣,在測序反應體系中, DNA 引物鏈不斷合成與偶然終止,產生一系列的長短不等的核苷酸鏈,然后將這些反應產物進行電泳,即可得測序圖譜。
樣品要求
樣品類型 | 相應要求 |
菌體 | 1. 說明載體抗性類型,我們提供 Amp, Kan, Tet 及 Chl 四種抗生素。 |
質粒 | 1. 質粒溶于適量體積雙蒸水中(不含 TE ),電泳檢測總量大于 2mg 。 2. 建議用相關試劑盒純化。 |
未純化 PCR 產物 | 1. 片段大于 150bp 。 |
純化 PCR 產物 | 1.PCR 產物溶于雙蒸水中(不含 TE )。 2. 濃度大于 20ng/ul ,體積大于 20ul ,長片段需適當增加量。 |
自備的引物 | 1. 濃度不低于 5pmole/ul( 或 5umol/L) ,體積大于 20ul 。 |