EndoFree Plasmid Mega Kit (5)-質(zhì)粒純化
純化得到至多2.5 mg無(wú)內(nèi)毒素超轉(zhuǎn)染級(jí)純質(zhì)粒或柯斯質(zhì)粒DNA
得到的DNA內(nèi)毒素低于0.1 EU/µg
純化流程快，同時(shí)去除內(nèi)毒素
獲得高產(chǎn)量高拷貝質(zhì)粒DNA
使用LyseBlue，獲得的裂解和高產(chǎn)量的DNA
EndoFree Plasmid Kit基于陰離子交換技術(shù)，可快速制備不含內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA。QIAfilter Cartridges通過(guò)過(guò)濾快速澄清裂解液，DNA產(chǎn)量至多500 μg（Maxi）、2.5 mg（Mega）和10 mg（Giga）。制備的DNA純度超過(guò)兩次CsCl梯度離心法所得DNA的純度，非常適合超轉(zhuǎn)染級(jí)純的應(yīng)用。
質(zhì)粒純化方法與轉(zhuǎn)染效率。
使用兩種方法獨(dú)立制備pRSVcat，分別使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染到COS-7、HeLa和LMH細(xì)胞中，及使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞中。平均轉(zhuǎn)染效率以相對(duì)于QIAGEN Plasmid Kit制備的DNA的轉(zhuǎn)染效率表示。
QIAGEN Plasmid Kit procedures.
Neutralized bacterial lysates are incubated directly in the QIAfilter Cartridge and cleared in seconds by filtration. After the endotoxin removal step, the cleared lysate is then loaded onto the anion-exchange tip where plasmid DNA selectively binds under appropriate low-salt and pH conditions. RNA, proteins, metabolites, and other low-molecular-weight impurities are removed by a medium-salt wash, and ultrapure plasmid DNA is eluted in high-salt buffer. The DNA is concentrated and desalted by isopropanol precipitation and collected by centrifugation.
質(zhì)粒純度與轉(zhuǎn)染效率。
圖中顯示了在無(wú)血清條件下，在懸浮液中生長(zhǎng)的CHO SSF3 X9細(xì)胞中，質(zhì)粒DNA的數(shù)量和質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。每個(gè)點(diǎn)代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值；Rel. LU：相對(duì)光單位。（數(shù)據(jù)由瑞士巴塞爾諾華公司的M. Zang-Gandor提供。）
細(xì)菌細(xì)胞壁。
大腸桿菌細(xì)胞壁示意圖。
EndoFree Plasmid Mega Kit (5)-質(zhì)粒純化
EndoFree Plasmid Mega Kit將高效的內(nèi)毒素去除步驟整合到質(zhì)粒純化過(guò)程中，不需要額外步驟，也不需用親和柱去除脂多糖。通過(guò)QIAfilter Mega-Giga Cartridge過(guò)濾細(xì)菌裂解液，通過(guò)重力流QIAGEN-tip 2500陰離子交換柱純化質(zhì)粒DNA。從500 ml–2.5 l培養(yǎng)液中至多純化2.5 mg DNA（培養(yǎng)液體積取決于質(zhì)粒拷貝數(shù)量、插入片段大小、宿主菌和培養(yǎng)介質(zhì)。）純化的DNA無(wú)內(nèi)毒素（<0.1 EU/µg DNA）。
EndoFree Plasmid Kits去除細(xì)菌在裂解過(guò)程中釋放的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素會(huì)影響原代細(xì)胞和敏感培養(yǎng)細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染。從EndoFree Plasmid Kits得到的無(wú)內(nèi)毒素DNA高度適用于可重復(fù)且結(jié)果可靠的轉(zhuǎn)染。QIAGEN超純無(wú)內(nèi)毒素DNA也適用于基因治療研究、基因免疫研究和其他敏感應(yīng)用。
| 質(zhì)粒準(zhǔn)備方法 | 內(nèi)毒素(EU?/µg DNA) | 平均轉(zhuǎn)染效率? |
|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Kit | 0.1 | 154% |
| QIAGEN Plasmid Kit | 9.3 | 100 |
| 2x CsCl | 2.6 | 99% |
| Silica-gel slurry | 1230.0 | 24% |
| DNA 純化方法 | 轉(zhuǎn)染細(xì)胞百分比 |
|---|---|
| EndoFree Plasmid Kit | 21.0% ± 0.93 |
| QIAGEN Plasmid Kit | 8.1% ± 0.57 |
| Silica-gel slurry | 5.2% ± 0.74 |
純化的質(zhì)粒DNA內(nèi)毒素污染水平取決于所用的純化方法。硅膠技術(shù)純化的DNA具有非常高的內(nèi)毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和兩次CsCl超速離心可獲得相對(duì)低水平內(nèi)毒素的純DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的內(nèi)毒素去除步驟，獲得<0.1 EU/µg的質(zhì)粒DNA。
QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊設(shè)計(jì)的過(guò)濾裝置，用于代替細(xì)菌細(xì)胞堿裂解后的離心步驟。QIAfilter Cartridges可wanquan去除SDS沉淀，清除細(xì)菌裂解液，相比離心可大量節(jié)約時(shí)間，減少1小時(shí)的質(zhì)粒純化時(shí)間。QIAfilter Mega-Giga Cartridges采用內(nèi)部真空的方式輕松的澄清大量的細(xì)菌裂解物。
QIAGEN-tips中dute的陰離子交換樹(shù)脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）專為核酸純化而開(kāi)發(fā)。它的分離性能使得DNA純度與連續(xù)兩次CsCl梯度離心獲得的DNA純度相當(dāng)。由重力流驅(qū)動(dòng)并持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的預(yù)裝QIAGEN-tips，限度減少手動(dòng)制備質(zhì)粒所需的時(shí)間。整個(gè)QIAGEN質(zhì)粒純化系統(tǒng)不使用有毒物質(zhì)，如benfen，氯仿，溴化乙錠和CsCl，限度地減少對(duì)用戶和環(huán)境的危害。
內(nèi)毒素，又稱脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的組成部分，如大腸桿菌。內(nèi)毒素在質(zhì)粒解裂純化過(guò)程中釋放，并顯著地降低內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞株轉(zhuǎn)染效率。此外，內(nèi)毒素與DNA競(jìng)爭(zhēng)“自由”轉(zhuǎn)染試劑，影響轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。內(nèi)毒素也誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等免疫細(xì)胞中非特異性免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染結(jié)果的誤讀。這些反應(yīng)包括誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)和脂類，如IL -1和前列腺素的合成。總體而言，內(nèi)毒素在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中是不可控變量，影響結(jié)果的可重復(fù)性，使它們難以對(duì)比、解讀。在基因治療研究中，內(nèi)毒素可造成內(nèi)毒素休克綜合癥和激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)，干擾研究。
在堿性條件下，細(xì)菌細(xì)胞裂解，用QIAfilter Mega-Giga Cartridge清除粗裂解物。將Endotoxin Removal Buffer加入到過(guò)濾后的裂解液中。冰浴后，將純凈的裂解物上樣到陰離子交換柱上，在適當(dāng)?shù)牡望}和pH條件下，質(zhì)粒DNA選擇性結(jié)合。用中鹽緩沖液清除RNA、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他低分子量雜質(zhì)，超純質(zhì)粒DNA被高鹽緩沖液洗脫。DNA由異丙醇脫鹽、沉淀并且離心回收。
使用EndoFree Plasmid Kits純化的DNA適合多種敏感應(yīng)用，包括：
轉(zhuǎn)染，包括原代、敏感和懸浮細(xì)胞
基因治療研究
基因沉默
顯微注射
特點(diǎn) | 參數(shù) |
| Applications | Transfection, gene therapy |
| Culture volume/starting material | 500 ml – 2.5 liters culture volume |
| Plasmid type | High-copy, low-copy, cosmid DNA |
| Processing | Manual (vacuum and centrifugation) |
| Samples per run; throughput | 1 sample per run |
| Technology | Anion-exchange technology |
| Time per run or prep per run | 220 min |
| Yield |
