產品信息
貨號 | 名稱 | 規格 |
GMP-M062-01A | Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade | 500U |
GMP-M072-01A | mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase, GMP Grade | 2500U |
GMP -S062 | SAM (32mM), GMP Grade | 0.5ml |
M062-YH01-01A | Vaccinia Capping System | 500U |
M072 | mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase | 2500U/2500U×5 |
產品簡介
Cap 0-和 Cap 1-mRNA 之間的差異在 RNA 5'端一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基，在高等真核細胞中，該甲基化是天然加帽過程的一部分，Cap 1 結構提高了 mRNA 的翻譯效率。mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase 能在 RNA 5′末端緊鄰帽結構的第一個核苷酸的 2′-O 上添加甲基基團，利用 S-腺苷硫氨酸（SAM）作為甲基供體，使帶帽 Cap 0 甲基化為 Cap 1。該酶只能以帶 7-甲基鳥苷帽結構（m7GpppN）的 RNA 為底物，不會作用于 5′末端為 pN、ppN、pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥苷帽結構（m7GpppN）的 RNA 可通過近岸蛋白質 Vaccinia Capping System（貨號: M062）獲得。
圖1. mRNA 帽結構 2′ -O-甲基轉移酶作用機理。mRNA 的帽結構是由一個7-甲基鳥苷通過一個5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0 結構由相鄰的 RNA 鏈通過三種酶的依次反應形成。進一步形成 cap-1 結構需要 2′-O-甲基轉移酶的參與，該修飾可以降低 RNA 在體內引起的細胞先天免疫反應。本圖引自Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65.
本體系可用于 IVT RNA 的加帽反應，使加帽反應在 1h 之內完成，效率接近 100%。IVT 推薦使用近岸蛋白質 T7 High Yield RNA Transcription kit（貨號：E131）。
產品用途：
提高RNA的翻譯效率；
改善mRNA在顯微注射和轉染后的表達。
注意事項：
SAM：需事先計算好 SAM 的用量，在反應開始前把分裝的 32 mM 的儲備液稀釋成2 mM 的工作液。SAM 在 pH 7-8，37°C條件下不穩定，需要在反應開始之前新鮮配置。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。
Cap 0-RNA 的制備：IVT RNA 需進行純化并溶解于 RNase-free 水中，不能將 RNA 溶解在 EDTA 溶液或其他鹽溶液中。Cap 0-RNA 可通過近岸蛋白質 Vaccinia Capping System（貨號：M062）反應體系獲得。為減少反應步驟，也可通過在同一體系內添加兩種酶直接獲得 Cap1-RNA，該反應基于近岸蛋白質 Cap 1 Capping System（貨號：M082），試劑盒內涵蓋 Vaccinia Capping System和 mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase。
RNA 二級結構：一些 RNA 轉錄本可能形成穩定的二級結構（同源二聚體和發卡結構），如二級結構發生在轉錄本的 5'端會影響加帽效率。在與加帽酶反應之前加熱 RNA 可以去除轉錄產物 5′端的二級結構，如果轉錄產物的 5′端結構復雜，可以把加熱時間延長至 10min。
Poly(A) 尾：如果加帽的 RNA 需要添加 3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白質 E. coli Poly(A) Polymerase（貨號：M012）進行加尾。加帽和加尾后的 RNA 需在進行 RNA 轉染實驗前做純化處理。
RNase Inhibitor：在配置反應體系時，可以加入 0.5 µl 近岸蛋白質 RNase 抑制劑（貨號：E125），同時去掉等體積的 RNase-free 水。
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For research and manufacturing use only.
