氯離子通道具有多種重要的生理和細胞功能，包括調節pH值，體內穩態，有機溶質轉運，細胞遷移，細胞增殖和分化。氯離子通道代表了有價值的藥物靶標。許多慢性疾病狀態，例如囊性纖維化和Bartter綜合征，是由于氯化物通道功能的缺陷所致。該為研究氯離子通道提供了靈敏而穩定的比色方法。該測定法基于我們專有的碘化物指示劑（Iodide Blue ），用于測量碘化物濃度，該測定法檢測到的碘化物低至30 nM。Screen Quest 比色法氯離子通道檢測試劑盒提供了一種用于檢測氯離子通道的優化測定方法。該測定可以使用96孔或384孔微孔板進行，并易于適應自動化。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供的Screen Quest 比色法氯離子通道檢測試劑盒。
| 光吸收酶標儀 | |
| 吸收: | 630, 380, or 405nm |
| 推薦孔板： | 透明底板 |
樣品實驗方案
簡要概述
準備細胞
除去生長培養基
加入I-Loading Buffer，用篩選化合物處理細胞
用DPBS緩沖液洗滌細胞3次
用1X裂解液裂解細胞
添加等體積的I-sensor（50或25 µL）
將0.1X加到I- Sensor Enhancer（50或25 µL）
在室溫下孵育10秒至10分鐘
檢測380 nm，405 nm或630 nm處的吸光度
溶液配制
儲備溶液配制
細胞裂解緩沖液（1X）：將整個小瓶的10X細胞裂解緩沖液（組分D）添加到45 mL無菌H2O中，并充分混合。 注意：5 mL 1X細胞裂解緩沖液足以裝滿一塊板。 將未使用的1X細胞裂解緩沖液儲存在4℃。
工作溶液配制
I- Sensor Enhancer工作溶液（1X）：將50 µL 100X碘化物增強指示劑（組分B）加入5 mL無菌H2O中并充分混合。 注意：1X I- Sensor Enhancer工作溶液不穩定，請稀釋后2小時內使用。 注意：應單獨評估每個細胞系，以確定I-Sensor Enhancer溶液的稀釋度。 我們觀察到0.1X I-Sensor Enhancer工作溶液在某些細胞系中效果更好。
實驗步驟
1.碘化物流出測定
1.1從細胞板上吸出生長培養基。
1.2加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的預熱I-上樣緩沖液（組分C）并孵育2-4小時。
1.3全部吸出碘化物上樣緩沖液。 用DPBS或HBSS清洗細胞至少3次。
1.4在HBSS緩沖液中用激動劑處理細胞5分鐘。 注意：為篩選拮抗劑，將化合物與I上樣緩沖液孵育至少30分鐘，然后再用DPBS或HBSS緩沖液洗滌細胞。
1.5吸出上清液。
1.6通過添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X細胞裂解緩沖液來裂解細胞。
1.7進行碘化物測定。
2.用于碘化物流入分析
2.1從細胞板上吸出生長培養基。
2.2加入預熱的I-上樣緩沖液（組分C）和測試化合物100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）并孵育5分鐘。
2.3全部吸出碘化物上樣緩沖液。 用HBSS洗滌細胞3次。
2.4通過添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X細胞裂解緩沖液來裂解細胞。
2.5進行碘化物測定。
3.運行碘化物測定
3.1從碘化物流入/流出測定選擇的孔中添加50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Iodide Blue 指示劑（組分A）。
3.2向混合物中加入50 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的1X碘化物指示劑增強劑溶液。 注意：對于某些細胞系，您可能需要將增強劑溶液稀釋至0.1X。
3.3在室溫下孵育10秒-10分鐘。 注意：應單獨評估每個細胞系，以確定孵育時間。 注意：由于存在高濃度的碘化物，藍色可能在數秒至數分鐘內變為黃色。
3.4檢測630、380或405 nm處的吸光度。
