抗體標記試劑盒ReadiLink Rapid mFluor 450蛋白標記試劑盒提供了一種以微觀方式標記抗體的方法。該試劑盒僅需要兩個簡單的混合步驟而無需純化步驟。 試劑盒中使用的iFluor 和mFluor 染料的琥珀酰亞胺酯（SE）表現出與蛋白質的脂族胺的良好反應性和選擇性，并形成羧酰胺鍵，其與天然肽鍵相同且穩定。 iFluor 和mFluor-抗體綴合物可用于免疫熒光染色，熒光原位雜交，流式細胞術和其他生物學應用。 每個ReadiLink 抗體標記試劑盒都提供了進行兩次偶聯反應（2x50μg蛋白質）的所有必需成分。 每個試劑盒可用于標記50-100μg單克隆，多克隆抗體或其他蛋白質（> 10 kDa），只需兩個簡單的混合步驟。抗體標記試劑盒ReadiLink Rapid mFluor 450是美國AAT Bioquest研發的產品。
標準操作規程（標記50μg蛋白質）
將所有組分加熱并在打開前將樣品瓶短暫離心，并在開始結合前準備所需的溶液。 以下SOP是標記抗HDAC IgG抗體的實例。
1.準備蛋白質溶液（溶液A）：
為了標記50g蛋白質（假設目標蛋白質濃度為1mg / mL），將5L（總反應體積的10％）的反應緩沖液（組分B）與50L目標蛋白質溶液混合。
注1.如果您的蛋白質濃度不同，請相應調整蛋白質體積，使~50μg蛋白質可用于標記反應。
注2：為了標記100g蛋白質（假設目標蛋白質濃度為1mg / mL），將10μL（總反應體積的10％）反應緩沖液（組分B）與100μL目標蛋白質溶液混合。
注3：蛋白質應溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中;如果蛋白質溶解在甘an酸緩沖液中，必須用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5超濾管，Ultracel-10超濾膜，10 kDa（來自Millipore的cat＃UFC501008）去除用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（如硫酸銨和乙酸銨）。
注4：不純的抗體、穩定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會被很好的標記。
注5：如果蛋白質濃度小于1 mg / mL，則結合效率會降低。為獲得標記效率，建議蛋白質濃度范圍為1-2 mg / mL。
2.運行結合反應：
2.1將蛋白質溶液（溶液A）加入到一瓶標記染料（組分A）中，通過反復移液幾次將其混合均勻，或將小瓶渦旋幾秒鐘。
注意：如果要標記100 µg蛋白質，請使用兩個小瓶（組分A），將100 µg蛋白質分成2 x 50 µg蛋白質，并使每個50 µg蛋白質與一小瓶標記染料反應，然后合并兩個小瓶，用于下一步。
2.2將綴合反應混合物在室溫下保持30-60分鐘。
注意：如果需要，可以旋轉或搖動綴合反應混合物更長的時間。
3.停止共軛反應：
3.1加入5 µL TQ染色淬滅緩沖液（組分C）（對于50 µg蛋白質）或加入10 µL TQ染色淬滅緩沖液（組分C）（對于100 µg蛋白質）。加入的緩沖液是總反應體積的10％。
3.2在室溫下孵育10分鐘。
3.3標記的蛋白質（抗體）完成。
