胱天蛋白酶Caspase抑制劑 SRB-VAD-FMK(Sulforhodamine B-VAD-FMK)是美國AAT Bioquest生產的用于Caspase的試劑，SRB-VAD是一種紅色熒光細胞滲透性胱天蛋白酶抑制劑，可靶向caspase 1,2,3,6,8,9或10.一旦進入細胞內，該抑制劑與活性caspase共價結合，產生綠色熒光。當添加到細胞群中時，SRB-VAD-FMK探針進入每個細胞并共價結合位于活性胱天蛋白酶異二聚體的大亞基上的反應性半*殘基，從而抑制進一步的酶活性。結合的標記試劑保留在細胞內，而任何未結合的試劑將擴散出細胞并被洗掉。綠色熒光信號是添加試劑時細胞中存在的活性半胱天冬酶量的直接量度。可以通過基于96孔板的熒光測定法，熒光顯微術或流式細胞術分析含有結合的標記試劑的細胞。該探針具有與Cy3®和TRITC類似的光譜特性，因此Cy3®和TRITC的濾光片組可以方便地與流式細胞儀或顯微鏡一起使用。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優質的胱天蛋白酶Caspase抑制劑 SRB-VAD-FMK(Sulforhodamine B-VAD-FMK)。
樣品操作及分析
以下方案僅提供指導，實際情況應根據您的特定需求進行修改。
使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物檢測胱天蛋白酶的常規方案
1.在DMSO中準備10 mM的儲備溶液。
2.如下準備2X半胱天冬酶底物（50 µM）分析溶液：50 µL底物原液，100 µL DTT（1M），400 µL EDTA（100 mM），10 mL Tris Buffer（20 mM），pH = 7.4。
3.將等體積的半胱天冬酶標準品或樣品與2X半胱天冬酶底物測定溶液混合，并在室溫下孵育至少1小時。
4.使用熒光酶標儀監測熒光，或使用酶標儀監測吸光度。
使用細胞滲透性FMK Caspase探針檢測細胞Caspase的方案
1.在DMSO中準備2-5 mM的儲備溶液。
2.根據需要處理細胞。
3.通過用20 mM Hepes緩沖液（HHBS）在Hanks中稀釋DMSO儲備溶液（來自步驟2.1），制備2X滲透性半胱天冬酶底物（20 µM）分析溶液。
4.將等體積的處理過的細胞與2X半胱天冬酶底物測定溶液混合（來自步驟2.3），并在37°C，5％CO2的培養箱中孵育細胞至少1小時。
5.用HHBS清洗細胞至少一次。
6.通過流式細胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標儀監測熒光強度。
使用細胞滲透性FMK Caspase探針進行細胞半胱天冬酶測定（僅適用于＃13470-13476）
1.通過向小瓶中加入50 µL DMSO制備250X儲備液。
2.根據需要處理細胞。
3.以1：250的比例將250 X DMSO儲備溶液添加到細胞溶液中（例如2 µL至500 µL細胞），并將細胞在37°C，5％CO2的培養箱中孵育1小時。
4.用HHBS清洗細胞至少一次。
5.通過流式細胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標儀監測熒光強度。
