胱天蛋白酶Caspase抑制劑 TF4-VAD-FMK是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于Caspase的試劑，TF4 -VAD是一種紅色熒光細(xì)胞滲透性polycaspase抑制劑靶向胱天蛋白酶1 ，2，3 ，6，8 ，9或10 。一旦進(jìn)入細(xì)胞，所述抑制劑共價(jià)結(jié)合于胱天蛋白酶活性，其產(chǎn)生的綠色熒光。當(dāng)加入到細(xì)胞群體中， TF4 -VAD -FMK探針進(jìn)入每個(gè)細(xì)胞和共價(jià)結(jié)合到駐留在胱天蛋白酶活性的異二聚體的大亞基，從而抑制進(jìn)一步的酶活性的反應(yīng)性半*殘基。結(jié)合的標(biāo)記試劑被保留在細(xì)胞內(nèi)，而任何未結(jié)合的試劑將擴(kuò)散出細(xì)胞，并沖走。綠色熒光信號(hào)的直接測(cè)量活性胱天蛋白酶的存在于細(xì)胞中的試劑加入的時(shí)間量。含有結(jié)合的標(biāo)記試劑細(xì)胞可以通過(guò)96 - 孔板的基于熒光，熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。探針具有相似的Texas Red的光譜特性，從而Texas Red的濾波器集合®可以方便地用流式細(xì)胞儀或顯微鏡使用。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供的胱天蛋白酶Caspase抑制劑 TF4-VAD-FMK。
樣品實(shí)驗(yàn)方案
樣品操作及分析
以下協(xié)議僅提供指導(dǎo)，應(yīng)根據(jù)您的特定需求進(jìn)行修改。
使用AMC，AFC，pNA，R110和ProRed底物的常規(guī)解決方案胱天蛋白酶測(cè)定
1.在DMSO中準(zhǔn)備10 mM的儲(chǔ)備溶液。
2.如下準(zhǔn)備2X半胱天冬酶底物（50 µM）分析溶液：50 µL底物原液，100 µL DTT（1M），400 µL EDTA（100 mM），10 mL Tris Buffer（20 mM），pH = 7.4。
3.將等體積的半胱天冬酶標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與2X半胱天冬酶底物測(cè)定溶液混合，并在室溫下孵育至少1小時(shí)。
4.使用熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光，或使用酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)吸光度。
使用細(xì)胞滲透性FMK Caspase探針的細(xì)胞Caspase測(cè)定
1.在DMSO中準(zhǔn)備2-5 mM的儲(chǔ)備溶液。
2.根據(jù)需要處理細(xì)胞。
3.通過(guò)用20 mM Hepes緩沖液（HHBS）在Hanks中稀釋DMSO儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟2.1），制備2X滲透性半胱天冬酶底物（20 µM）分析溶液。
4.將等體積的處理過(guò)的細(xì)胞與2X半胱天冬酶底物測(cè)定溶液混合（來(lái)自步驟2.3），并在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞至少1小時(shí)。
5.用HHBS清洗細(xì)胞至少一次。
6.通過(guò)流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。
使用細(xì)胞滲透性FMK Caspase探針進(jìn)行細(xì)胞半胱天冬酶測(cè)定（僅適用于＃13470-13476）
1.通過(guò)向小瓶中加入50 µL DMSO制備250X儲(chǔ)備液。
2.根據(jù)需要處理細(xì)胞。
3.以1：250的比例將250 X DMSO儲(chǔ)備溶液添加到細(xì)胞溶液中（例如2 µL至500 µL細(xì)胞），并將細(xì)胞在37°C，5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。
4.用HHBS清洗細(xì)胞至少一次。
5.通過(guò)流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。
