Amplite NAD檢測試劑盒 （熒光法）藍色熒光是美國AAT Bioquest研發的檢測NAD的試劑盒，煙X胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）及其氧化形式（NAD）是活細胞中發現的許多酶反應的必需輔助因子。 量化這些因子的產生或消耗是監測酶介導的反應或篩選這些酶反應的調節劑或底物的重要方法。 市場上有幾種用于量化NADH或總NAD / NADH量的試劑盒，但是迄今為止在大量過量NADH存在下檢測NAD是非常具有挑戰性的，因為NAD在259 nm處具有其吸收峰且不發熒光， 使測量不實用。
Amplite 熒光NAD分析試劑盒可便捷，快速地檢測NAD。 該試劑盒使用我們新開發的NAD傳感器Quest Fluor NAD試劑直接測量NAD。 該試劑盒中使用的專有探針僅與NAD反應產生在Ex / Em = 420 / 480nm處熒光的產物，并且對NADH幾乎沒有響應。 該試劑盒可在100μL測定體積中檢測少至30 nM的NAD，并在過量的NADH存在下監測0.3％的NAD產生。 該測定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行，并且可以用于高通量篩選。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優質的Amplite NAD檢測試劑盒 （熒光法）藍色熒光。
實驗方案
96孔板檢測示例
概述
準備NAD標準品或測試樣品（50μL）
添加20μLQuestFluor NAD探針添加20μL
測定溶液在室溫下孵育10-20分鐘
添加15μL增強劑溶液
在室溫下孵育10-20分鐘
監測420/480 nm的熒光
注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分。
操作步驟
1.準備NAD庫存解決方案：
將500μlddH2 O加入到NAD標準品（組分D）的小瓶中以制備1mM NAD儲備溶液。
注意：未使用的NAD儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20 ℃。
2.準備NAD標準品的系列稀釋液（0至10μM）：
2.1將10μLNAD儲備溶液（來自步驟1）加入990L H2O或PBS緩沖液中以產生10M NAD標準溶液。
注意：稀釋的NAD標準溶液不穩定，應在4小時內使用。
2.2取200μL10μMNAD標準溶液，在H2O或PBS中進行1：3連續稀釋，得到NAD標準品的10,3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM連續稀釋液。
2.3如表1所述，將50μL系列稀釋的NAD標準品和含有NAD的測試樣品加入黑色/固體底96孔微孔板中：
表1在黑色/固體底96孔微孔板中的NAD標準品和測試樣品的布局
BL | BL | TS | TS |
NS1 | NS1 | …. | …. |
NS2 | NS2 | ||
NS3 | NS3 | ||
NS4 | NS4 | ||
NS5 | NS5 | ||
NS6 | NS6 | ||
NS7 | NS7 |
注1：NS = NAD標準，BL =空白對照，TS =測試樣品。
注2：將連續稀釋的NAD標準品從10μM加到0.01μM加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。
3.運行NAD測定：
3.1將20μLQuestFluor NAD探針（組分A）溶液加入NAD標準品，空白對照品和測試樣品的每個孔中，充分混合。
3.2將20μL測定溶液（組分B）加入每個孔中，充分混合。
注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和10μLQuestFluor™NAD Probe和10μLAssaySolution。
3.3在室溫下孵育反應10-20分鐘，避光。
3.4向每個孔中加入15μL增強劑（組分C），使總NAD測定體積為105μL/孔，并在室溫下孵育10-20分鐘，避光。
注意：對于384孔板，添加7.5 uL增強劑。
3.5使用熒光板讀數器在420/480 nm處檢測熒光增加。
