Amplite NADPH檢測試劑盒(比色法) 是美國AAT Bioquest研發的檢測NADPH的試劑盒，煙X胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙X胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定基于監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測定的短紫外波長使得傳統方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite 比色NADPH檢測試劑盒為檢測NADPH提供了一種便捷的方法。 NADPH探針是一種生色傳感器，在NADPH減少時具有460nm的大吸光度。 NADPH探針的吸收與溶液中NADPH的濃度成正比。 Amplite 比色NADPH檢測試劑盒提供靈敏的檢測方法，可在100μL檢測體積中檢測低至3μM的NADPH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優質的Amplite NADPH檢測試劑盒(比色法) 。
實驗方案
96孔板檢測示例
概述
準備NADPH反應混合物（50μL）
加入NADPH標準品或測試樣品（50μL）
在室溫孵育或15分鐘至2小時
孵育460 nm處的監測吸光度
注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。
操作步驟
1.準備NADPH原液：
將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標準品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）NADH儲備溶液。
注意：未使用的NADH儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。
2.準備NADPH反應混合物：
將1mL NADPH探針（組分A）加入4mL NADPH測定緩沖液（組分B）中，并充分混合。
注意：5mL NADPH反應混合物用于一個96孔。 未使用的NADPH反應混合物應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。
3.準備NADPH標準品的連續稀釋液（0至100μM）：
3.1將100μLNADPH儲備溶液（來自步驟1）加入400μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，以產生200μM（100pmol / L）NADPH標準溶液。
注意：稀釋的NADPH標準溶液不穩定，應在4小時內使用。
3.2取200μL的200μMNADPH標準溶液進行1：2連續稀釋，得到NADPH標準品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM連續稀釋液。
如表1和2中所述，將NADPH標準品和含有NADPH的測試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養板中。
注意：根據需要制備細胞或組織樣品。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細胞（詳見附錄）。
表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH標準品和測試樣品的布局
| BL | BL | TS | TS |
| NS1 | NS1 | ... | ... |
| NS2 | NS2 | ||
| NS3 | NS3 | ||
| NS4 | NS4 | ||
| NS5 | NS5 | ||
| NS6 | NS6 | ||
| NS7 | NS7 |
注意：NS = NADPH標準，BL =空白對照，TS =測試樣品
表2每個孔的試劑組成
| NADPH | 空白對照 | 測試樣 |
| 連續稀釋：50 ul | PBS:50 ul | 50 ul |
*注意：將連續稀釋的NADPH標準品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份
4.在上清液反應中運行NADPH測定：
4.1將50μLNADPH反應混合物（來自步驟2）加入NADPH標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中（參見步驟3.3），使總NADPH測定體積為100μL/孔
注1：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADPH反應混合物。
注2：根據需要準備細胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細胞（詳見附錄）。
4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時，避光。
4.3用吸光度讀板儀在460 nm處檢測吸光度的增加。
