核酸PCR實驗室檢測具體流程
    近日，北京協和發布了病毒核酸檢測標準操作流程的培訓視頻，供其他符合條件的醫療機構在開展病毒核酸檢測時參考。

一、個人三級防護穿戴

帶一次性帽子、佩戴科研N95、一次性鞋套、一次性防水靴套、一層乳膠手套、外層一次性*、防護目鏡、第二層乳膠手套、穿戴完畢后應盡快通過緩沖間或者走廊，進入核酸提取區（業核酸提取實驗室）。

二、樣本滅活處理

核酸檢測須有兩名工作人員快速通過進入實驗室，進行滅活實驗操作。生物安全柜內需配備吸水棉與消毒酒精、有條件可配備吸水臺布，對樣本溢灑時進行緊急處理；打開二級容器，用75%酒精消毒物體表面，檢測樣本管密閉性后進行滅活處理，滅活條件（56℃，30min，恒溫樣本滅菌儀等多種方式），取出酒精滅活管用酒精擦拭外表，將樣本放入到生物安全柜內。

三、手工核酸提取

操作人員進入試劑配置區或者單獨的潔凈實驗室。

一、試劑區準備

根據說明說要求，在AW1中加入無水乙醇130mL，在AW2中加入無水乙醇160mL，計入無水乙醇后及時做好標記，在310μg的Carrier RNA中加入310μL AVE，并顛倒混勻使Carrier RNA充分溶解，就此完成洗液AW1、洗液AW2和Carrier RNA配置，而后通過傳遞窗傳送到樣本處理區，或者由人送到核酸提取實驗室中。

二、樣本的裂解

用1.5ml的無菌EP管，移液器移取560μl AVL裂解液，加入5.6μl Carrier RNA，加入140μl的已滅活的待提取核酸的待測樣本，渦旋振蕩15s，室溫靜止10min。將上述EP管放入離心機內瞬時離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產物，防止污染。裂解完成后，加入560μl無水乙醇，振蕩混勻15s，將上述EP管放入離心機內瞬時離心以去除可能殘留在EP管蓋上的裂解產物，防止污染。

向離心柱加入裂解產物630μl，8000轉離心1min，若離心機在生物安全柜之外，每次使用都需進行外表面消毒。更換新廢液收集管，要從離心機中小心取出離心柱，將上層離心柱轉移到新收集管中，繼續將剩余裂解產物630μl加入離心柱中，若樣本體積大于140μl時需重復此步驟，直到全部裂解產物都過柱離心，8000轉離心1min，小心將離心柱轉移到新的收集管中。

取500μl AW1加入離心柱中（注意，此處加樣操作時務必將移液器吸頭接觸離心柱內壁緩慢加樣），8000轉離心1min。小心取出離心柱，更換新的收集管。

取500μl AW2加入離心柱中，14000轉離心3min，小心取出離心柱，更換新的離心柱上端收集管，置于離心機中使用大轉速離心1min，以確保將AW2中的殘液*離心干凈。

取無菌1.5mlEP管收集核酸，將離心柱上端小心放入1.5mlEP管中，取40-60μl的洗脫液AVE加入到離心柱中（注意：洗脫液應盡量全部覆蓋住離心柱膜），用EP管管蓋蓋住離心柱，使用無菌剪刀剪去原離心柱管蓋。

室溫靜止1min，將其放入離心機中8000轉離心1min，回收核酸。丟棄離心柱，EP管中即為獲取的提取核酸，做好標記與登記。

四、用儀器提取核酸

首先按照說明說準備*，將200μl滅活樣本添加到*中，根據核酸提取儀的設置程序上機提取核酸，等儀器操作結束，提取核酸完成，回收核酸。

五、PCR體系配置

根據檢測樣本數量配制體系，將配制好的PCR體系充分混勻并離心后，將其通過傳遞窗送至樣本處理核酸加樣區，或單獨的樣本加樣實驗室。按照每孔分裝20μL反應體系，進行分裝，在各孔分別加入5μL待測樣本核酸或陰陽對照物（請注意每次檢測器包含1個陽性對照和3個陰性對照且陰性對照需隨機分布），密封PCR管，有條件時模板加樣盡量在單獨的生物安全柜進行。

工作人員將配好的PCR管通過傳送窗口送至PCR擴增區，或由人送至PCR擴增實驗室，上機檢測。

六、核酸PCR實驗室檢測上機檢測及結果分析

工作人員進入基因擴增分析實驗室，從傳遞窗取出PCR反應管，上機前需混勻并離心反應體系，按試劑盒說明說設置擴增參數并分析判讀結果。分析結果時，嚴格閱讀說明說充分了解試劑盒靈敏度、方法學局限性等綜合判讀實驗結果。

為防止擴增污染，反應結束后的PCR擴增管嚴禁開蓋并裝入密封帶中裝入的垃圾桶中。

七、檢測后的消毒處理

樣本處理完成后，工作人員應用75%的酒精消毒處理外層手套并脫下外層手套，放入生物安全柜中的生物垃圾桶中。檢測完成后，生物安全柜臺面和地面應用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇進行擦拭。將安全柜內產生的醫療垃圾用三層垃圾袋密封，并將其放入垃圾桶中，垃圾袋上需標記醫療垃圾信息。實驗結束后，生物安全柜以及實驗室均要進行紫外燈照射消毒，時間至少30min。

實驗操作人員，應有他人用0.5-1%的有效氯消毒劑或75%乙醇對一次性*均勻噴霧消毒處理，而后脫去*將檢測科研垃圾放入制定垃圾桶中，工作人員在離開二級實驗室后，應在緩沖區或走廊按順序摘脫個人三級防護用品，首先應帶新的外層手套，摘掉護目鏡并置于75%乙醇中消毒，自上而下、自內向外翻轉脫掉一次性，脫去外層手套，摘除、一次性帽子、脫一次性鞋套。脫掉手套，病毒均需進行高壓滅菌處理。高壓前后醫療垃圾嚴格區分。

病毒相關垃圾需在120度，30min條件進行濕熱高壓處理，以高壓試紙條變色為有效，而后作為普通醫療垃圾處理。