2XRAPA3GPCR Mix
貨號 | 規格 | 分類 |
XG-P2978 | 1ml | PCR相關 |
XG-P2978 | 10ml | PCR相關 |
| RAPA3G DNA聚合酶為經電子重構架的第三代Taq DNA聚合酶，第三代DNA聚合酶具有高度的雜質耐受性、長片段擴增能力、高擴增成功率、高產量等特征，從而使得RAPA3G系列產品可用于粗制樣品的直接擴增，無需核酸純化步驟。雜質耐受性方面，該酶可耐受植物中的多糖多酚；全血、血清、血漿中的肝素、高濃度的血紅蛋白、甘油三脂；乙醇；胍鹽；SDS等強PCR抑制劑。在血液直擴PCR實驗中，RAPA3G PCR Mix性能與KAPA3G DNA聚合酶展現出同等的表現，其性能表現優于二代聚合酶（血液擴增Hemo KlenTaq Mix）。在植物直擴PCR實驗中，RAPA3G PCR Mix在配合DNA釋放劑的條件下與KAPA3G Plant PCR試劑盒性能一致。 長片段擴增能力方面，使用該酶可輕松擴增8kb的基因組片段，20kb的λ DNA，8kb的cDNA。該酶具有6kb/min以上的擴增速度，可顯著的縮短PCR的擴增時間，在常規測試條件下，10s的延伸時間可完成1kb的基因組DNA擴增。在PCR擴增成功率方面，與其它類型的PCR擴增試劑對比中，RAPA3G PCR Mix表現出的PCR擴增成功率。此外，該酶包含一定比例的RAPA HiFi超保真DNA聚合酶，因此其具有一定的保真性能（經藍白斑測試，其保真性能約為Taq DNA聚合酶的56倍）。另外，RAPA3G系列產品均采用專有的熱啟動技術，確保50°C以下無活性，僅有95°C加熱5min以后才能恢復其活性，因此可限度的提高擴增的特異性，減少非特異性產物的產生。該PCR Mix具有5'-3'的聚合酶活性、5'-3'的外切酶活性和3'-5'的外切酶活性，產物部分帶有"A"尾巴，部分為平末端，因此產物均可用于TA克隆或平端克隆。 | ||||||||||||||||||||||||||
特征和用途 | ||||||||||||||||||||||||||
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RAPA3G DNA聚合酶對抑制物耐受性 | ||||||||||||||||||||||||||
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50μl體積建議添加的樣品量 | ||||||||||||||||||||||||||
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儲存 | ||||||||||||||||||||||||||
| 長期儲存置于-20°C以下，可保存2年，避免反復凍融；短期使用置于4°C（3個月）保存，一經融化后請放置于4°C，勿再凍存。 | ||||||||||||||||||||||||||
反應實例 | ||||||||||||||||||||||||||
| 1. 模板適應性強，長片段和短片段都可有效擴增 | ||||||||||||||||||||||||||
| Lane 1：λDNA 500bp, 2：λDNA 1kb, 3：λDNA 2kb, 4：λDNA 5kb, 5：λDNA 8kb, 6：λDNA 15kb, 7：λDNA 20kb, 8：human 500bp ,9：human 1kb, 10：human 2kb ,11：human 5kb, 12：human 8kb, 13：cDNA 166bp, 14：cDNA 552bp, 15：cDNA 960bp, 16：cDNA 1574bp, 17：cDNA 1705bp, 18：cDNA 2755b,p 19：cDNA 4128bp, 20：cDNA 7600bp, M：DNA Marker 10000 | ||||||||||||||||||||||||||
| 選取三種DNA模板，使用RAPA3G PCR Mix進行擴增，循環數統一為28 cycles，結果如上圖所示，對于不同種類DNA模板和不同長度的靶基因，RAPA3G PCR Mix均有良好的擴增性能。 | ||||||||||||||||||||||||||
| 2. 對于粗制樣品DNA具有的耐受性 | ||||||||||||||||||||||||||
| 分別以人全血、血清、葉片粗制品DNA以及大豆種子粗制品DNA為模板，使用RAPA3G PCR Mix進行PCR擴增，結果如上圖展示，各種粗制樣品都有良好的擴增，其中全血和血清可耐受15%。 | ||||||||||||||||||||||||||
| 3.擴增靈敏度高，λDNA模板低至0.1pg也可以有效擴增 | ||||||||||||||||||||||||||
| 以λDNA為模板，選取不同模板使用量，采用RAPA3G PCR Mix進行擴增2kb靶基因，循環數統一為28 cycles，結果如上圖所示，λDNA模板低至0.1pg也可以有效擴增 | ||||||||||||||||||||||||||
一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；
二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；
三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成 等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；
四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；
五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；
六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。
七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。
八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。
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