注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號(hào) |
馬動(dòng)脈炎病毒PCR檢測試劑盒說明書 | Equine Arteritis Virus(EAV)RTPCR | BK-P9136 |
原理是由一對引物介導(dǎo)，能在動(dòng)植物體外對特定基因(DNA)片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增，經(jīng)過n個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴(kuò)增效率＝倍，使得檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM） 2μl
引物2（10PM） 2μl
Taq酶（2U/μl） 1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
司他斯汀 CAS 59767-13-4 * 規(guī)格： 100mg
CAS * 規(guī)格： 100mg
左氧星 CAS 177325-13-2 * 規(guī)格： 100mg
石吊蘭 CAS * 規(guī)格： 2g
3-吲哚 CAS * 規(guī)格： 10mg
苯雌二醇 CAS * 規(guī)格： 100mg
20（S）-原人參三醇 CAS * 規(guī)格： 20mg
蒙花苷 CAS 480-36-4 * 規(guī)格： 20mg
雌 CAS * 規(guī)格： 100mg
賴氨匹林 CAS 62952-06-1 * 規(guī)格： 100mg
桂利嗪 CAS 30484-77-6 * 規(guī)格： 100mg
羚羊角 CAS * 規(guī)格： 1g
酒石酸雙氫因 CAS * 規(guī)格： 50mg
滿山白 CAS * 規(guī)格： 2g
前列腺特異性抗原(PSA) CAS * 規(guī)格： 3支/套，0.5ml/支
馬動(dòng)脈炎病毒PCR檢測試劑盒說明書呂宋馬杜拉放線菌 Actinomadura luzonensisNCI-H520(人肺鱗細(xì)胞)
釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae唾桿菌水楊素亞種 Lactobacillus salivarius subsp. salicinius
FC33(人胚胎腎細(xì)胞(Asp-2基因修飾))5×106cells/瓶×2
苜蓿中華瘤菌 Sinorhizobium meliloti威德摩爾鏈霉菌 Streptomyces wedmorensis
酸菌體培養(yǎng)基/Lactobacillus Fluid Medium250克國產(chǎn)/進(jìn)口
MN-s, 小鼠紋狀體神經(jīng)元 Mouse
細(xì)菌總數(shù)顯色培養(yǎng)基/Total Genes Chromogenic Medium檢測細(xì)菌總數(shù)，培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)菌顯紅色250毫升國產(chǎn)/進(jìn)口
人腺細(xì)胞 LCC1
葡萄汁酵母 Saccharomyces uvarumMA, 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞
1% NaC1阿拉伯糖發(fā)酵管BR20支國產(chǎn)/進(jìn)口
PBS人宮頸細(xì)胞
技術(shù)原理：
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。
在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）
發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。
