Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer
貨號(hào) | 規(guī)格 | 分類 |
XG-P3042 | 100ml | 蛋白相關(guān) |
| 對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測分析時(shí)，總蛋白的提取至關(guān)重要，如蛋白提取不好會(huì)導(dǎo)致后續(xù)試驗(yàn)的不理想甚至失敗，如：信號(hào)極弱或無雜交信號(hào)、背景高、非特異性條帶多等.根據(jù)目標(biāo)蛋白的類型和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用種類來選擇合適的RIPA裂解液，才能程度地保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功。 對(duì)細(xì)胞有一定的裂解能力，能獲得較多的胞漿蛋白，而對(duì)細(xì)胞核的裂解能力有限，不能裂解細(xì)胞核，因此獲得的總蛋白適用于IP或CO-IP實(shí)驗(yàn)；而WB Super RIPA Lysis Buffer對(duì)動(dòng)物組織和細(xì)胞的裂解能力強(qiáng)，它可以裂解細(xì)胞核和線粒體，并可提取到更多的膜蛋白，從而可獲得更多的總蛋白。因其強(qiáng)的裂解能力，使得大量的基因組DNA從細(xì)胞核中釋放出來，使蛋白變的十分粘稠，使用Benzonase核酸酶消化可有效解決。經(jīng)RIPA裂解液獲得得蛋白可用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；使用Bradford法測定由本裂解液裂解所得到樣品的蛋白濃度會(huì)稍有誤差。 | ||
| Fig.用WB Super RIPA Lysis Buffer和分別提取核蛋白PPARγ和膜蛋白PLD-1，上樣量分別為40ug和10ug總蛋白，ECL發(fā)光液顯色。A/C泳道為WB Super RIPA Lysis Buffer，B/D泳道為。由此圖比較分析表明WB Super RIPA Lysis Buffer能更充分的釋放核蛋白和膜蛋白，從而獲得更強(qiáng)的信號(hào)。 | ||
一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；
二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；
三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成 等生物學(xué)過程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；
四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；
五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；
六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。
七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來判別DNA片段大小的工具。
八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；
①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長片段、全長產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。
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