pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒

描述：本試劑盒所包含的原核表達載體(pCold-SUMO-10His)是在 pCold-SUMO 載體基礎上改造而成，

該載體啟動子(CS Promoter)來源于南極嗜冷細菌，在低溫下(15 度)才能啟動蛋白的表達。低溫下細菌生長緩慢，使得蛋白合成速度減慢，從而最大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率，提高了蛋白可溶性表達，增強了活性蛋白的表達比率。該表達系統所包含的 SUMO tag 可以極大地提高小分子量蛋白的表達量，而且進一步提高了蛋白的可溶表達幾率。同時，TEE 信號肽可增強冷啟動子調控下目的蛋白的高表達。
改進后的 pCold-SUMO-10His 載體，其 SUMO 蛋白標簽含有 10 個組氨標簽（10His tag），使其結合 Ni-NTA 的能力更強。與較早版本的 pCold-SUMO 表達系統相比，pCold-SUMO-10His 表達系統在保留了原有統的蛋白可溶性能生產能力、高特異性剪切能力的情況下，對 Ni-NTA 結合能力的得到明顯提高。其對 Ni-NTA 結合能力的提高，

在以下三個方面改善了生產重組蛋白的性能：

（1）提高了粗蛋白樣品中目標蛋白的捕獲能力，從而提高純化產量；

（2）在蛋白純化過程中可以
使用更高濃度的咪唑進行漂洗，去雜蛋白的能力明顯提升，從而獲得更高純度的重組蛋白；

（3）在重組蛋白酶切去除 SUMO標簽后，利用 Ni-NTA 去除 SUMO 標簽更為，獲得純度更高的無標簽目標蛋白。
關于宿主菌的使用：本試劑盒配備了兩種宿主表達菌感受態細胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受態和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受態，兩種感受態均為凍干品形式可長期保存在-20℃，效價無明顯下降（2~10X10e5 cfu/μg）。
通常在質粒載體的構建完成，并測序驗證后，可將重組質粒轉入該感受態進行蛋白表達。該宿主菌僅為蛋白表達生產用，不可以進行載體構建和質粒的提取制備。由于 pCold-SUMO 系統的高可溶性表達特性，在大多數情況下重組蛋白在 LyophilizedArctic (DE3)感受態即可獲得理想的可溶表達，因此實驗請選用 Lyophilized Arctic (DE3)感受態宿主菌。

在 LyophilizedArctic (DE3)感受態宿主菌可溶表達效果不理想的情況下，再選用操作相對復雜的、帶有輔助折疊伴侶分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌，該系統可獲得的可溶表達。除此外，pCold-SUMO 系統在常規 BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌內均可獲得可觀的可溶性表達。
關于蛋白酶的使用：試劑盒配備了 SUMO 蛋白酶（酵母來源，也稱為 UIP 蛋白酶）和 rTEV 蛋白酶，在步載體構建過程中需要評估、考慮兩個蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶識別蛋白結構，切割活性高、酶切，對于需要去除 Tag的重組蛋白其是。個別情況下 SUMO 標簽的結構會受到 C 端重組目標蛋白的影響，使得 SUMO 蛋白酶對重組融合蛋白的切割效率降低、甚至是無效，此時再選用 rTEV 蛋白酶進行酶切。由于 rTEV 蛋白酶識別氨基酸序列，個別重組融合蛋白會包埋識別序列，因此也會導致蛋白酶切效率下降。由于重組融合蛋白結構的無法預測性，因此在實驗過程中兩種蛋白酶的酶切均需要測試。無論如何，通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率。本試劑盒配備的 SUMO 蛋白酶可以識別 SUMO標簽結構（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位點位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有雙 His 標簽，保證了 SUMO 蛋白酶高親力的結合 Ni-NTA，以最大限度的去除 SUMO 蛋白酶（分子量約 26kD）。rTEV 蛋白酶可以識別 SUMO 標簽后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在識別位點 Gln-Gly(QG)之間進行切割，從而去除 SUMO 標簽。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 標簽（分子量約 30kD），可使用 Ni-NTA 純化介質去除。
本試劑盒配備的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 為蛋白表達陽性質粒，該質粒含有 43kD 的目標蛋白，其與SUMO 標簽（19kD）融合后分子量約為 62kD。該表達質粒在 Arctic (DE3)中即可獲得良好的表達。其可以僅可做為表達、酶切實驗的陽性對照品。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。