注意事項:1.基礎(chǔ)程序;2.?dāng)U增溫度和延伸溫度;3.反應(yīng)時間;4.循環(huán)次數(shù);5.PCR 反應(yīng)液的配制;6.PCR技術(shù)的基本原理;7.PCR的反應(yīng)動力學(xué);8.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;9.PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
產(chǎn)品名稱 | 豬細(xì)小病毒PCR檢測試劑盒廠家 |
規(guī)格 | 50T |
貨號 | LZP7918 |
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板:一塊(96孔)
2、 標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品): 2瓶,請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為200 U/L,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋),分別配制成200 U/L,100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液:1×20ml。
4、 檢測稀釋液A:1×10ml。
5、 檢測稀釋液B:1×10ml。
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實(shí)驗過程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個的PCR實(shí)驗室。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實(shí)驗與實(shí)驗之間的連續(xù)性。
6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻。
L-精氨酸SNAT1/SLC38A1 (D9L2P) Rabbit mAbBoc-1-氨基環(huán)戊烷羧酸
L-精氨酸鹽酸鹽DIDO1 Antibody氟甲
DL-精氨酸RanGAP1 (D2T7T) Rabbit mAb2-(三酰)吡咯
L-纈氨酸NCAM (CD56) Antibody三氟化-二甲絡(luò)合物
L-異亮氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品)NEDD4 (C5F5) Rabbit mAb1-(2-甲氧基)哌
L-異亮氨酸Notch1 (D1E11) XP® Rabbit mAb二氟溴酸
L-蘇氨酸CDK10 (D8Z7Z) Rabbit mAb氨基甲酰
DL-蘇氨酸Phospho-Tuberin/TSC2 (Thr1462) Antibody1,1,1-三三氟烷
L-氨酸Tuberin/TSC2 Antibody五氟烷
L-天冬酰;L-天冬酰一水 Phospho-Tuberin/TSC2 (Tyr1571) Antibody2-氨基-3,5-二溴吡啶
L-甲硫氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Tuberin/TSC2 (Ser939) Antibody全氟己基烷
L-甲硫氨酸Phospho-Tuberin/TSC2 (Ser939) Antibody1-叔丁基-
L-胱氨酸HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb3,5-二甲基哌啶
L-胱氨酸鹽酸鹽HIF-1α (D1S7W) XP® Rabbit mAb4,5-二甲基噻唑
L-半胱氨酸Phospho-Tuberin/TSC2 (Ser1254) Antibody氨基-羥基磺酰
L-半胱氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Tuberin/TSC2 (Thr1462) (5B12) Rabbit mAb2,3,4,5-四甲氧
L-半胱氨酸鹽酸鹽,一水Phospho-Tuberin/TSC2 (Thr1462) (5B12) Rabbit mAb1,5-二-戊酮
DL-半胱氨酸CDC37 (V297) Antibody2,5-二甲氧基
鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶2(CAMK2)ELISA試劑盒SLC24A5 可溶性載質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC24A5100 ul
鈣調(diào)素(CAM)ELISA試劑盒Slc26a5 Slc26a520 ul
鈣調(diào)酸酶(CaN)ELISA試劑盒SLC6A19 鉀依賴鈉鈣交換蛋白6100 ul
鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶(CaMKK)ELISA試劑盒SLC16A3/MCT-4 MCT420 ul
富亮氨酸α2糖蛋白1(LRG1)ELISA試劑盒Smac/DIABLO 線粒體促凋亡蛋白100 ul
復(fù)制蛋白A 70kDaDNA結(jié)合亞基(RPA1)ELISA試劑盒SLC33A1 酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白120 ul
脯氨酸羥化酶(PHD)ELISA試劑盒SLC34A2 酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白100 ul
縫隙連接蛋白α1,43kDa(GJA1)ELISA試劑盒SMN1 運(yùn)動神經(jīng)元生存蛋白120 ul
封閉蛋白4(CLDN4)ELISA試劑盒Slit2/Slil3 神經(jīng)遷移蛋白Slit2/3100 ul
豬細(xì)小病毒PCR檢測試劑盒廠家表皮生長因子抗體(小鼠)N-Acetyl-L-tyrosine中文名:乙酰酪氨酸別名:分子式:C11H134
表皮生長因子抗體(大鼠)4-Acetylbiphenyl中文名:4-乙酰基聯(lián)苯別名:分子式:C14H12O
豬源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌K88-K99抗體N-Acetyl-m-toluidine中文名:N-乙酰間甲別名:分子式:C9H11
表皮生長因子受體III型突變體抗體Allopuril中文名:別嘌醇別名:分子式:C5H4N4O
eIF4E結(jié)合蛋白抗體Adipic dihydrazide中文名:己二酸二酰肼別名:分子式:C6H14N4O2
檢測步驟:
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX),冰上融化并振蕩混勻后,10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照),每個測試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
(1) 計算好各試劑的使用量,加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中,充分混勻,10000rpm離心10s,向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液,向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL,10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團(tuán):設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán):NONE,請勿選擇ROX參比熒光。