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產品描述

本試劑盒為Annexin V與PI聯合使用的試劑盒，用于檢測細胞凋亡早期的發生，可區分凋亡早期凋亡細胞和晚期凋亡或壞死細胞。

Annexin V為胞內蛋白膜聯蛋白家族成員，以鈣離子依賴的方式選擇性與磷脂酰*(PS)結合。PS正常分布在細胞膜內側。PS外翻到細胞膜外是不同類型的細胞在凋亡早期的明顯特征，用帶有FITC標記的Annexin V，即Annexin V-FITC，可通過流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測到這一重要特征。FITC呈現黃綠色熒光。

PI（Propidium Iodide, 碘化丙啶）是一種可對 DNA 染色的細胞核染色試劑，在嵌入DNA 后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細胞膜，但可以穿透壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞。

Annexin V-FITC與PI聯合使用時，PI 被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被 FITC 和PI 結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）。

FITC能達到的吸收波長和激發波長分別為494nm和518 nm，PI-DNA復合物能達到的吸收和發射波長分別為535 nm和617 nm。

產品組分

保存方法

2~8℃避光保存，一年有效。注意不可冷凍。

使用方法

下列實驗方案以利用星形孢菌素誘導 Jurkat 細胞凋亡為例，如果使用其他誘導劑和其他類型的細胞，實驗條件需要略作調整。

1.流式細胞檢測

（1）根據實驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經處理的細胞樣品，作為陰性對照。此外，建議設定一組樣品做單染，用于調節補償。

（2）收集細胞。

懸浮細胞：300 g，4℃離心 5 min 收集細胞；

貼壁細胞：用不含 EDTA 的*消化后 300 g，4℃離心 5 min收集細胞，*消化時間不宜過長，以防引起假陽性。

【注】：用*消化然后使細胞在適宜的細胞培養條件和培養基中恢復約30 min，然后再染色。 *消化會暫時破壞質膜，允許Annexin V結合磷脂酰*在細胞膜的細胞質表面上，從而導致假陽性染色。

（3）用預冷的PBS 洗滌細胞兩次，每次均在 300 g，4℃下離心 5 min，收集 1-5×105 個細胞并用100 μL 1×結合緩沖液重懸細胞。

（4）每管加入 4-5 μL 的 FITC-Annexin V 和 5 μL 的 PI工作液。

【注】：我們*準備兩管額外的流式管，每管只加入一種單染染料（FITC-Annexin V 和PI），用于流式單染的補償調節。

（5）室溫避光孵育 10-15 min，為避免細胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作。

（6）每管加入 400 μL 的 PBS 或 1×結合緩沖液，盡快通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。FITC-Annexin V 可以由 488nm 激光激發，檢測熒光發射光譜約在 530 nm 處（FITC 通道），PI 通道發射光譜約在 617 nm 處。

【注】：PBS 或 1×結合緩沖液的選擇根據不同凋亡處理以及不同細胞具體選擇。

2.熒光顯微鏡檢測

對于懸浮細胞，可參照流式細胞檢測的方法進行具體操作。

（1）在蓋玻片或載玻片小室中接種細胞。

（2）根據實驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經處理的細胞樣品，作為陰性對照。

（3）用 PBS 洗滌細胞。

【注】：細胞收集后如果不用 PBS 清洗，可以用含血清的培養基直接替代Annexin V 結合緩沖液，但是 Annexin V 的使用濃度需要重新優化。

（4）每 100 μL 的 Annexin V 結合緩沖液中加入 5-25 μL 的 FITC-Annexin V 和 5 μL 的 PI。

【注】：使用濃度由具體實驗要求確定。

（5）向培養板中加入足量的染液以覆蓋全部細胞，室溫避光孵育 15-30 min。為避免細胞凋亡進程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時間至少延長至 30 min。

（6）用 1×結合緩沖液清洗細胞。

（7）將孵育有細胞的蓋玻片置于載玻片上，載玻片可提前加一滴 1×結合緩沖液；對于培養在小室內的細胞，可直接加入足量的 1×結合緩沖液覆蓋細胞。

（8）使用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀察細胞。FITC-Annexin V 可用 FITC 適用的濾光片，PI 可用 Cy3 或者 Texas。

注意事項：

1.該產品*于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2.熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。