PCR特異性：
1.primers design
這是重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面一些條件：
1)足夠長，18～24bp，以保證特異性，當然，不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產量；
2)GC%，40%~60%；
3)5'端和中間序列要多GC，以增加穩定性；
4)避免3'端GCrich，個BASE不要有GC，或者5個有3個不要是GC。
5)避免3'端的互補，否則，容易造成DIMER；
6)避免3'端的錯配；
7)避免內部形成二級結構；
8)附加序列(RT site，Promoter sequence)加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結構要加上它們；
9)使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意：生物偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度(1μM～3μM)；
10)學會使用一種design software，PP5，Oligo6，DNA star，Vector NTI，Online design et al。
產品名稱：鴕鳥源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒
英文名稱：
貨號：XG01P4322
分類：熒光定量PCR試劑盒
儲存條件：-20℃避光保存，避免反復凍融。
運輸：低溫、避光，快遞免費送貨上門。
熒光定量PCR實驗步驟：
①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
實時定量PCR：
①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應體系如下：
標準品反應體系
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 陽性模板上游引物F 0.5μl
3 陽性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 陽性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
香菇 Lentinula edodes黑曲霉 Aspergillus niger
IBRS-2(豬腎細胞)圓弧青霉 Penicillium cyclopium
苜蓿中華根瘤菌 Sinorhizobium meliloti釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae
QGY-7701(人肝細胞)Hacat(人永生化角質形成細胞)
大鼠腦成纖維細胞*培養基苜蓿中華根瘤菌
A-498(人腎細胞)HL-60, 人早幼粒白血病細胞
少孢根霉
凍膠假絲酵母 Candida gelida
香菇 Lentinula edodes
HSC-T6(大鼠肝星形細胞)5×106cells/瓶×2
涇陽鏈霉菌 Streptomyces jingyangensis
大鼠小腦顆粒細胞*培養基100mL
大鼠海馬神經元細胞*培養基100mL
鴕鳥源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒>十羰基四銠
硝釓,六水
硝釓,六水
2-溴-5-甲氧基溴芐
2-溴茴香硫醚
2-溴茴香硫醚
2-溴茴香硫醚
3,5-基苯并噻吩
3,5-基苯并噻吩
2,4--5-甲氧基嘧啶
基因反應體系：
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 內參照上游引物F 0.5μl
3 內參照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待測樣品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。
