一、細胞基本屬性

細胞特性

1）來源：T淋巴細胞

2）形態：淋巴細胞樣，懸浮生長

3）含量：>1×10?細胞數

4）規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5）用途：僅供科研使用。

運輸和保存：干冰運輸及復蘇好存活細胞：

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）懸浮細胞：T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養基和細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養瓶中（加入按照說明書細胞培養條件新配制的培養基）。

備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的培養基來培養細胞。收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代。

一．培養基及培養凍存條件準備

1）準備RPMI-1640培養基；優質胎牛血清，10%；GlutaMAX-1谷an酰胺，1%， 雙抗，1%。

2）培養條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二．細胞處理：

1）凍存細胞的復蘇：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

懸浮狀態下生長的細胞，可以通過向培養瓶中添加培養基來維持細胞的生長狀態，一般情況下細胞密度維持在1×10?~1×10?個/mL（不同細胞對密度要求不同，）可以維持細胞的正常生長。如需分瓶可以將細胞懸液收集到離心管中1000rpm，離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存:收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。下面T25瓶為例：

1、細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個活細胞/ml.

2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10?~1×10?個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3、將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。

注意事項：

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產生飛揚的碎屑造成人員傷害。

使用范圍

本產品僅限于科學研究，絕不可作為動物或人類疾病的治療產品使用。

二、細胞培養操作

1) 復蘇細胞：以下細胞培養凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養基的培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL培養基，培養過夜）。第三天換液并檢查細胞密度。

2) 細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養。

a、細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時，棄25cm2培養瓶中的培養液，用PBS清洗細胞一次；

b、添加0.25%消化液約1ml至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入培養液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

c、棄上清，沉淀細胞用12ml培養基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，最后放入37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

d、待細胞貼壁后，觀察培養結果，之后進行換液培養或傳代。

3) 細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為例；

a、細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時，棄25cm2培養瓶中的培養液，用PBS清洗細胞一次；

b、添加0.25%消化液約1ml至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入培養液終止消化，輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

c、用適量的凍存液（FBS：DMSO=9 ：1）重懸細胞，并放置于凍存管中；

d、先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉入液氮中進行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。

三、培養注意事項

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，若有上述現象 發生請及時和我們聯系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態、所用培養基、血清比例、所需 細胞因子等，確保細胞培養條件一致，若由于培養條件不一致而導致細胞出現問題，責任由 客戶自行承擔。

3. 用 75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態。因運輸問題，部分細胞由于溫度 變化及劇烈碰破碎形成碎片，是正常現象。觀察好細胞狀態后，75%酒精消毒瓶壁將 T25 瓶置于 37℃培養箱放置 2-4h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm 離心 3 min，棄上 清。加 5 mL PBS 重懸細胞，再 900 rpm-1000 rpm 離心 3 min，用新鮮的培養基重懸 細胞，并接種到新的培養瓶或培養皿中，置于培養箱中進行培養。

5. 請客戶用相同條件的培養基用于細胞培養。

6. 建議客戶收到細胞后前 3 天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和我司技術部溝通 交流。由于運輸的原因，個別敏感細胞會出現不穩定的情況，請及時和我們聯系，告知細胞 的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養基 (灌液培養基) 不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培 養條件新配制的培養基來培養細胞。     收到細胞后次傳代建議 1：2 傳代 。

9. 注意：  1:2 傳代就是 1 個 T25 瓶傳 2 個 T25 瓶或者 2 個 6cm 皿。不是 1 個 T25 瓶傳 2 個10cm 皿。

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