攝取脂肪酸是治療許多人類(lèi)疾病（例如肥胖癥，2型糖尿病和肝脂肪變性）的重要治療目標(biāo)。Screen Quest™熒光脂肪酸攝取測(cè)定試劑盒為測(cè)量含有脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的細(xì)胞中的脂肪酸攝取提供了一種簡(jiǎn)單而靈敏的方法。該套件使用專(zhuān)有的十二酸熒光脂肪酸底物。可以在具有底部讀取模式或FITC通道的任何熒光酶標(biāo)儀上進(jìn)行此脂肪酸攝取測(cè)定試劑盒。該測(cè)定可以在96孔或384孔微量滴定板中以簡(jiǎn)單的混合和讀取程序進(jìn)行，并且很容易適用于高通量篩選應(yīng)用。
平臺(tái)
| 熒光酶標(biāo)儀 | |
| 激發(fā) | 485納米 |
| 發(fā)射 | 515納米 |
| 隔斷 | 495納米 |
| 推薦板 | 黑墻/透明底 |
| 儀器規(guī)格 | 底讀模式 |
組件
| 組分A：TF2-C12脂肪酸 | 1小瓶，凍干 |
| 組分B：測(cè)定緩沖液 | 1瓶（10毫升） |
| 成分C：DMSO | 1小瓶（100 µL） |
協(xié)議范例
乍看上去
協(xié)議摘要
平板細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中4-6小時(shí)
將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)血清培養(yǎng)基中1小時(shí)，然后根據(jù)需要處理細(xì)胞
添加100 µL /孔的脂肪酸上染溶液
立即監(jiān)測(cè)動(dòng)力學(xué)在Ex / Em = 485/515 nm時(shí)的熒光增強(qiáng)，或在孵育60分鐘后監(jiān)測(cè)終點(diǎn)讀數(shù)（底部讀數(shù)模式）
重要說(shuō)明
開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鏊性噭┖薪M件。
儲(chǔ)備溶液的制備
除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，制備后應(yīng)儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
TF2-C12脂肪酸儲(chǔ)備溶液：
將20 µL DMSO（組分C）添加到TF2-C12脂肪酸（組分A）小瓶中，并充分混合。注意：20 µL的熒光脂肪酸底物儲(chǔ)備液足以裝一板。如果將試管緊密密封并避光，則可以將未使用的熒光脂肪酸底物原液分裝并在< -20 o C下保存兩個(gè)月。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
準(zhǔn)備工作溶液
加載脂肪酸染料的溶液：
將20 µL TF2-C12脂肪酸儲(chǔ)備溶液添加到10 mL的測(cè)定緩沖液（組分B）中，并充分混合。注意： 10毫升脂肪酸染料上樣溶液足以裝滿一盤(pán)；為每個(gè)盤(pán)子準(zhǔn)備新鮮的食物并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
程序
細(xì)胞制備：
根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞。以下方案是制備3T3-L1脂肪細(xì)胞的指南。
準(zhǔn)備分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞（參見(jiàn)參考文獻(xiàn)1）：3T3-L1成纖維細(xì)胞在DMEM / FBS匯合后在75 cm燒瓶中培養(yǎng)2天，然后在補(bǔ)充有0.83 µM胰島素，0.25 µM的DMEM / FBS中培養(yǎng)2天。disaimisong和0.25 mM異丁基甲基huangpiaoling。更換培養(yǎng)基以維持disaimisong和IBMX不在另外2天的胰島素濃度。然后將培養(yǎng)基更換為單獨(dú)的DMEM / FBS，持續(xù)3-5天。在分化誘導(dǎo)后的第8至12天使用分化的細(xì)胞（其中至少95％通過(guò)脂質(zhì)液滴的積累顯示出脂肪細(xì)胞表型）。
在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以50,000-80,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 100 µL / 96孔或12,500-20,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 25 µL / 384孔黑墻/透明底部細(xì)胞培養(yǎng)板接種3T3-L1脂肪細(xì)胞，用Poly-D賴氨酸板固定4個(gè)實(shí)驗(yàn)前-6小時(shí)。斷開(kāi)制動(dòng)器，以800 rpm的速度離心板2分鐘。 注意：建議將3個(gè)僅含生長(zhǎng)培養(yǎng)基的孔（無(wú)細(xì)胞）平板作為空白孔進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化。 注意：我們發(fā)現(xiàn)在同一天（4-6小時(shí)，然后血清被剝奪1小時(shí)）接種的脂肪細(xì)胞比接種過(guò)夜的脂肪細(xì)胞效果更好。
從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞板，從孔中吸出培養(yǎng)基，并用90 µL /孔/ 96孔板或20 µL /孔/ 384孔板的無(wú)血清培養(yǎng)基剝奪細(xì)胞。將細(xì)胞在37oC，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。
通過(guò)添加10 µL /孔/ 96孔板（5 µL /孔/ 384孔板）或1X Hanks和20 mM Hepes緩沖液（1X HBSS，pH 7.4）或您選擇的緩沖液來(lái)處理細(xì)胞復(fù)合稀釋劑。對(duì)于空白孔，添加化合物稀釋劑。將細(xì)胞在37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育所需的時(shí)間（對(duì)于用胰島素處理的3T3-L1細(xì)胞，則需要30分鐘）。
樣本協(xié)議：
根據(jù)需要用測(cè)試化合物處理細(xì)胞。
從培養(yǎng)箱中取出經(jīng)過(guò)化合物處理的細(xì)胞板，添加100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）（包括空白孔）的脂肪酸染料上載溶液。
使用底部讀取模式，使用熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 485/515 nm（在495 nm處截止）下測(cè)量熒光信號(hào)。注意：對(duì)于動(dòng)態(tài)讀數(shù)：以20秒的間隔立即讀取熒光強(qiáng)度，持續(xù)30-60分鐘。注意：對(duì)于終點(diǎn)讀數(shù)：在30-60分鐘孵育結(jié)束時(shí)讀取熒光強(qiáng)度。
