DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型）使用說(shuō)明書
（貨號(hào)：WLE8202KIT）
原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域，并開始對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。本試劑盒在39 ºC下，依賴核酸外切酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計(jì)的特異的分子探針，使用熒光監(jiān)測(cè)設(shè)備能實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短（僅需20 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡(jiǎn)便，易于保存。
可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀、恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀器等熒光檢測(cè)設(shè)備。
引物設(shè)計(jì)：
建議使用長(zhǎng)度在30-35 bp的引物，引物過(guò)短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長(zhǎng)度建議在150-300 bp，通常不超過(guò)500 bp。
熒光探針設(shè)計(jì)：
探針序列不與特異性引物識(shí)別位點(diǎn)重疊，長(zhǎng)度為46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有四個(gè)修飾位點(diǎn)：距離5’端的≥35 nt的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（，THF），作為核酸外切酶的識(shí)別位點(diǎn)；THF位點(diǎn)的上游標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，下游標(biāo)記一個(gè)粹滅基團(tuán)，兩個(gè)基團(tuán)的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer。
試劑盒組成：
組成 | 含量 |
A buffer | 1.6 mL×1管 |
B buffer | 150 μL×1管 |
正對(duì)照模板 | 30 μL×1管 |
正對(duì)照引物探針Mix | 70 μL×1管 |
試劑 | 48份 |
使用說(shuō)明書 | 1份 |
試劑盒儲(chǔ)存：
運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸；
儲(chǔ)存條件：儲(chǔ)存溫度 ≤ -20 ºC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；
產(chǎn)品有效期：12個(gè)月。
操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
1) 每個(gè)干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需*融化混勻，否則會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；
2) 每個(gè)反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對(duì)于多個(gè)反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；
3) 向反應(yīng)管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為13.5 μL）；
4) zui后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，上下顛倒反應(yīng)管8-10次混勻）；
5) 混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入熒光檢測(cè)設(shè)備中。熒光檢測(cè)程序設(shè)置為：恒溫39 ºC；每30 s采集一次FAM通道（信號(hào)采集通道的選擇與熒光探針設(shè)計(jì)一致）熒光值；反應(yīng)時(shí)間20 mins。
注：如使用ABI系列PCR儀，請(qǐng)務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none”。
體系配制 正對(duì)照熒光結(jié)果圖
組分 | 體積（μL） |
A buffer | 29.4 2 |
上游引物(10 μM)* | |
下游引物(10 μM)* | 2 |
探針(10 μM)* | 0.6 |
ddH2O 和DNA模板 | 13.5 |
B buffer | 2.5 |
總體積 | 50 |
*正對(duì)照反應(yīng)單元體系配制：正對(duì)照模板加入2μL，引物與探針加入4.6 μL正對(duì)照引物探針Mix（已包含探針和上/下游引物），其他組分參照體系配制。
N：陰性對(duì)照； P：正對(duì)照 |
注意事項(xiàng)：
1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)請(qǐng)注意避免微量核酸污染，并盡量考慮設(shè)置空白對(duì)照以確認(rèn)是否有核酸污染。
2． 試劑盒保質(zhì)期12個(gè)月。每次使用時(shí)，請(qǐng)取出實(shí)驗(yàn)所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，置于冰浴條件下并在8小時(shí)內(nèi)使用；剩余部分，請(qǐng)置于存儲(chǔ)條件下。
| DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型） | WLB8201KIT | 48份/盒 | 3300 |
| DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型） | WLE8202KIT | 48份/盒 | 3300 |
| DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型） | WLN8203KIT | 48份/盒 | 3300 |
| RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型） | WLRN8206KIT | 48份/盒 | 3360 |
| RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型） | WLRB8204KIT | 48份/盒 | 3360 |
| RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型） | WLRE8205KIT | 48份/盒 | 3360 |
| HybriDetect試紙條 | WLFS8201 | 50條/包 | 1800 |
