1 、實時PCR原理
番茄潰瘍病菌PCR試劑盒對擴增產物進行可重復性的定量長期以來一直是科學家和研究者的目標。傳統(tǒng)的方法需要對終產物進行凝膠電泳分析。
這種方法可以確定目的產物和競爭產物的大小，估算純度，計算條帶強度。然而，所用擴增試劑和體系的變動會造成擴增的終產物的重復性有較大的變動，成為這種方法的主要弊端.
擴增過程的指數(shù)期提供給我們有用的，可重復的數(shù)據(jù)。在起始的目的DNA量與循環(huán)過程的指數(shù)期的擴增產物量之間存在著定量關系。這正是實時擴增的基礎。
隨著DNA內嵌染料和探針特異性化學的發(fā)展，實時探測量子學的跳躍發(fā)展推動了對擴增過程的研究進展。
今天的實時設備由熒光讀數(shù)計和熱循環(huán)儀組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實時分析軟件以圖表的形式顯示。
在擴增的每個循環(huán)中至少收集一次熒光數(shù)據(jù)來進行擴增的實時監(jiān)控。用戶能夠根據(jù)一個一個的循環(huán)知道那個樣品正在擴增。這些即時的數(shù)據(jù)允許用戶看清楚各個樣本相對于標準品，陽性對照和陰性對照是如何擴增的。用戶不僅能在擴增過程中監(jiān)督整個反應，還可以根據(jù)反饋的信息來優(yōu)化相應程序。因此增加了敏感性，特異性和有效性。
原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化后可以設定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。
樣品到達域值水平所經歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點的循環(huán)數(shù)）。域值應設定在使指數(shù)期的擴增效率為大，這樣可以獲得準確，可重復性的數(shù)據(jù)。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標準品，線性回歸分析將產生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。
2、 探測化學物質
有5種主要類型的探測化學物質用于實時擴增，包括：
2.1 內嵌染料
2.2 雙標記探針
2.3 FRET探針
2.4 分子信標
2.5 Ampliflor
2.1內嵌染料（Sybr-Green I ）
內嵌染料，例如Sybr-Green I ，能與雙鏈DNA結合
1 SG不與單鏈DNA結合，熒光信號強度較低
2 SG與雙鏈DNA結合，熒光信號強度極大的增強
番茄潰瘍病菌PCR試劑盒SG是一種熒光染料，能結合到DNA雙螺旋的小溝。處于溶解狀態(tài)的未結合染料顯示低的熒光強度，一旦結合到雙鏈DNA之后熒光信號增強。這種特性被利用在實時擴增中。由于在擴增反應中DNA增加，染料結合到擴增產物上，熒光信號增強。
熒光信號相對背景水平的增加進行分析。根據(jù)擴增子的長度有多個熒光染料的分子結合到雙鏈DNA上。內嵌染料可以和所有其他傳統(tǒng)擴增成分，例如水，緩沖液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到擴增反應管中。
因為不需要設計序列特異性探針和新的引物對，這種方法是一種簡便，性價比較高的實時監(jiān)測方法。
