馬秋博病毒染料法熒光定量PCR試劑盒自誕生以來(lái)，人們就在努力探索PCR定量的方法。熒光素染色凝膠電泳在PCR初的一段時(shí)間是的檢測(cè)技術(shù)，因此人們?cè)谀z電泳的基礎(chǔ)上使用掃描照片進(jìn)行光密度分析，以求實(shí)現(xiàn)PCR的相對(duì)定量。
但是由于普通凝膠電泳檢測(cè)本身的不特異性，只能進(jìn)行粗略的相對(duì)定量，難以滿足人們?nèi)找鎸?duì)精確定量的渴望，不過(guò)由于普通凝膠電泳光密度分析簡(jiǎn)捷易行，成本低，目前還是科研還很常用。但是難以滿足臨床應(yīng)用的要求。
由于固相捕獲技術(shù)的成熟和應(yīng)用，特別是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的成功，給核酸定量提供了一個(gè)思路。此后，應(yīng)用固相捕獲的PCR定量技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。即在PCR擴(kuò)增以后，在微也板上借用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的原理，使用酶標(biāo)抗體，進(jìn)行固相雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)定量。被稱為PCR－ELISA ：
PCR－ELISA原理：
首先，使用親和素包被微孔板，再用生物素標(biāo)記捕獲探針3`端（捕獲探針5`端和待檢靶序列5`端的一段互補(bǔ)）通過(guò)生物素和親和素的交聯(lián)作用將捕獲探針固定在微孔上，制成固相捕獲系統(tǒng)。
其次，在擴(kuò)增時(shí)，引物用抗原（生物素、熒光素酶等）標(biāo)記，這樣擴(kuò)增產(chǎn)物中就會(huì)代有抗原。
用擴(kuò)增產(chǎn)物與微孔上的捕獲探針雜交，靶序列被捕獲。再在微孔中加入用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，抗體與靶序列上的抗原結(jié)合，再加入底物使之顯色。從而實(shí)現(xiàn)定量。
雖然PCR經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的探索，PCR－ELISA逐漸成熟，并有了不同的改進(jìn)版本，但總的還是沒(méi)有脫離固相分離、酶標(biāo)抗體的經(jīng)*疇。
PCR－ELISA的步驟：
1.核酸提取和制備
2.進(jìn)行PCR擴(kuò)增
3.微孔預(yù)雜交
4.產(chǎn)物雜交
5.顯色
6.檢測(cè)分析
PCR－ELISA的優(yōu)點(diǎn)：
馬秋博病毒染料法熒光定量PCR試劑盒相對(duì)于凝膠光密度定量，無(wú)論是靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度上都是很大的提高，能滿足臨床要求。它為PCR提供了*個(gè)嚴(yán)格意義上的定量方法。并且對(duì)儀器要求較低。只要有擴(kuò)增儀和酶標(biāo)儀就可以進(jìn)行。
PCR－ELISA的不足及消減措施：
1.污染問(wèn)題嚴(yán)重。PCR－ELISA在擴(kuò)增之后又要進(jìn)行ELISA反應(yīng)，而ELISA是一個(gè)開(kāi)放性的反應(yīng)，特別是洗板，很容易產(chǎn)生污染引起假陽(yáng)性。為減小污染，一定要嚴(yán)格分區(qū)隔離，以避免污染。同時(shí)，使用dUTP與UNG酶也可以在一定程度上減小污染的影響。由于PCR產(chǎn)物都是高濃度的。一般情況下，產(chǎn)物都被擴(kuò)增至2的20方以上，即使避免了擴(kuò)增前的污染，但同批樣本產(chǎn)物之間的交叉污染可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ELISA，不能忽視。
2.顯色定量分析相對(duì)于近的探針熒光分析，無(wú)論是靈敏度還是特異性上都有差距。
3.操作繁瑣，這也是嚴(yán)重制約臨床應(yīng)用的重要因素。
