馬鈴薯病毒V型PCR試劑盒 (qPCR) 的新手,還是想了解實(shí)時(shí) PCR 的新應(yīng)用,我們都有相關(guān)學(xué)習(xí)材料,包括視頻和網(wǎng)絡(luò)研討會,幫助您理解這一技術(shù)并更快上手。
黑色普雷沃菌染料法熒光定量PCR試劑盒PCR 將 PCR 擴(kuò)增和檢測合并為單一步驟。這樣就無需使用凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物檢測,更重要的是這一方法是真正定量的。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 中,熒光染料被用來在熱循環(huán)中標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀器在反應(yīng)的對數(shù)期測定熒光信號的積累,獲得快速精確的 PCR 產(chǎn)物定量以及客觀的數(shù)據(jù)分析。
專題資源
步驟、過程
構(gòu)建一段寡核苷酸探針:5’端標(biāo)記熒光染料報(bào)告基團(tuán),3’端標(biāo)記淬滅染料基團(tuán)。當(dāng)探針保持完整時(shí),淬滅基團(tuán)的靠近會通過空間上的熒光共振能力轉(zhuǎn)移(FRET)而顯著降低由報(bào)告染料基團(tuán)發(fā)射的熒光。
如果存在目標(biāo)序列,探針便會在其中一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)的下游發(fā)生退火,并隨著引物的延伸通過Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性,完成切除。
探針的切除將會引起:
將報(bào)告染料基團(tuán)和淬滅染料基團(tuán)進(jìn)行分離,增強(qiáng)了報(bào)告染料基團(tuán)的信號。
將探針從目的鏈上去除,使引物繼續(xù)沿模板鏈末端延伸。因此,探針的介入并不會抑制整個(gè)PCR過程。
每經(jīng)過一個(gè)循環(huán),就會有更多的報(bào)告基因染料分子從各自的探針上切斷,熒光強(qiáng)度會隨著合成的擴(kuò)增片段數(shù)量的增加而增加。
兩種類型的 TaqMan 探針我們可提供兩種類型的Applied Biosystems TaqMan 探針:
馬鈴薯病毒V型PCR試劑盒TaqMan探針(含有Invitrogen TAMRA染料——淬滅染料基團(tuán))
Applied Biosystems TaqMan MGB探針
推薦用于等位基因檢測的 TaqMan MGB 探針
我們一般推薦使用TaqMan MGB探針進(jìn)行等位基因分型分析,特別是當(dāng)傳統(tǒng)TaqMan探針超過30個(gè)核苷酸時(shí)。TaqMan MGB探針包含:
位于3’ 端的非熒光淬滅基團(tuán)——由于淬滅基團(tuán)不發(fā)出熒光,因此SDS儀可以更精確地檢測出報(bào)告基因染料 。
位于3’ 端的小溝結(jié)合物 – 小溝結(jié)合物可提高探針的熔解溫度(Tm),縮短探針的長度。
終,TaqMan MGB 探針會在匹配和未匹配探針之間展現(xiàn)出更大的 Tm 值差異,從而提供更準(zhǔn)確的等位基因分型。
TaqMan 方法的優(yōu)點(diǎn)
需要在探針和目標(biāo)分子(靶點(diǎn))之間發(fā)生特異性的水解(雜交),方可生成熒光信號
您可使用明顯不同的報(bào)告基因染料標(biāo)記探針,在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增并檢測兩個(gè)不同的序列
無需PCR后處理,減少分析工作量并節(jié)省材料成本。
TaqMan方法的缺點(diǎn):
TaqMan方法的主要缺點(diǎn)在于需要根據(jù)不同的序列,合成不同的探針。