常見問題
青枯假單胞桿菌PCR試劑盒產(chǎn)物的電泳檢測時間
一般為48h以內(nèi)，有些于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶。
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體*，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul。或100 ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20 ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性
青枯假單胞桿菌PCR試劑盒出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶*，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不*，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

（1）PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

（2）如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？
A. 涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。
如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。
B. 轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。
例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。
C. 如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D. 用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

（3）對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？
A. 連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4℃過夜。
B. 插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C. 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D. 帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。
E. 高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株。
PCR反應(yīng)特點
特異性強 PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

靈敏度高 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中小檢出率為3個細(xì)菌。

簡便、快速 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

對標(biāo)本的純度要求低 不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測。

PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增 ，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計的*，特別是多重PCR，應(yīng)用多對引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。

瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。

酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。

分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

斑點雜交： 將PCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。
抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200 umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0 mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。
溫度與時間的設(shè)置：
基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300 bp時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。

②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4（G+C）+2（A+T）
復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）
在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間*結(jié)合。

③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1 Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1 min是足夠 的。3～4 kb的靶序列需3～4 min；擴增10 Kb需延伸至15 min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多