立克次體通用染料法熒光定量PCR試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1.即開(kāi)即用，用戶只需要提供DNA模板。
2.特異性高，引物是根據(jù)人幽門(mén)螺旋桿菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他細(xì)菌。
3.引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性比常規(guī)PCR高100倍。
4.提供無(wú)傳染性的PCR陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
5.一管式操作，熒光PCR檢測(cè)，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠50次20μL體系的PCR規(guī)格及成分
| 成分 | 十孔盒包裝 |
| 2×qPCR MagicMix | 0.5 mL（棕色） |
| 熒光PCR模板稀釋液 | 1 mL（亮黃蓋） |
| 幽門(mén)螺旋桿菌PCR引物混合液 | 100 μL（白蓋） |
| 幽門(mén)螺旋桿菌PCR陽(yáng)性對(duì)照 (1×10E8拷貝/μL) | 50 μL（紅蓋） |
| 天凈沙核酸釋放劑試用裝 | 20次（1mL，綠蓋） |
| 使用手冊(cè) | 1份 |
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月
自備試劑
樣品DNA
立克次體通用染料法熒光定量PCR試劑盒使用方法
一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3.在7號(hào)管中加入5 μL 陽(yáng)性對(duì)照（其濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7.用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8.如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定性分析，則6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選4號(hào)，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。
10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分：
| 成分 | N+2個(gè) 樣品管 | PCR陰性對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7管） |
| 2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
| 幽門(mén)螺旋桿菌 PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
| 自備10×ROX (見(jiàn)注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
| N+2個(gè)待測(cè)樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
| 自備超純水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
| 第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號(hào)） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3號(hào)管…） |
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對(duì)照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。
11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
四、熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)
| 過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 |
| 預(yù)變性 | 94℃ | 5 min |
| PCR反應(yīng) （40個(gè)循環(huán)） | 94℃ | 0.5 min |
| 50℃ | 0.5 min（采集SYBR通道的熒光信號(hào)） | |
| 72℃ | 0.5 min | |
| 后延伸 | 72℃ | 10min |
五、數(shù)據(jù)處理
12.設(shè)定60℃-96℃范圍的融解曲線分析，排除假陽(yáng)性。
13.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
14.如果把俄羅斯春夏腦炎病毒熒光定量PCR試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品
幽門(mén)螺旋桿菌可視化LAMP檢測(cè)試劑盒
