海德堡沙門氏菌染料法熒光定量PCR試劑盒具有下列特點:
1.即開即用,用戶只需要提供DNA模板。
2.特異性高,引物是根據人幽門螺旋桿菌高度保守區設計,不會擴增其他細菌。
3.引物和擴增體系經過優化,靈敏性比常規PCR高100倍。
4.提供無傳染性的PCR陽性對照,便于區分假陰性樣品。
5.一管式操作,熒光PCR檢測,不容易產生環境污染。本產品只能用于科研,本試劑盒足夠50次20μL體系的PCR規格及成分
成分 | 十孔盒包裝 |
2×qPCR MagicMix | 0.5 mL(棕色) |
熒光PCR模板稀釋液 | 1 mL(亮黃蓋) |
幽門螺旋桿菌PCR引物混合液 | 100 μL(白蓋) |
幽門螺旋桿菌PCR陽性對照 (1×10E8拷貝/μL) | 50 μL(紅蓋) |
天凈沙核酸釋放劑試用裝 | 20次(1mL,綠蓋) |
使用手冊 | 1份 |
運輸及保存
低溫運輸,-20℃保存,保存期限為12個月
自備試劑
樣品DNA
海德堡沙門氏菌染料法熒光定量PCR試劑盒使用方法
一、制備標準曲線樣品(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1.標記6個離心管,分別為7,6,5,4,3,2。
2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液,用帶芯槍頭,下同)。
3.在7號管中加入5 μL 陽性對照(其濃度為1×10E8拷貝/μL,試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7.用自選方法純化樣品的DNA,本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。
8.如果有N個樣品,則需要進行N+2個樣品提取,多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。本試劑盒免費贈送20次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝,該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板,省略了DNA提取步驟。
三、設置qPCR反應(20μL體系,在樣品制備室進行)
9.如果進行定量分析,則標記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于標準曲線樣品。如果做定性分析,則6個標準曲線樣品只選一個做(可以選4號,其余樣品不變)。以下只介紹定量分析的反應設置。
10.在標記管中按下表加入各成分:
成分 | N+2個 樣品管 | PCR陰性對照管 | 標準曲線 樣品管(2-7管) |
2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
幽門螺旋桿菌 PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
自備10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2個待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
自備超純水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
第7步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7號) | 不加 | 不加 | 各6μL(2號樣到2號管,3號樣到3號管…) |
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照,其他熒光PCR儀器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX,則用水替代。
11.蓋上蓋子后上機,按下面參數進行PCR(具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化)。
四、熒光定量PCR反應參數
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 94℃ | 5 min |
PCR反應 (40個循環) | 94℃ | 0.5 min |
50℃ | 0.5 min(采集SYBR通道的熒光信號) | |
72℃ | 0.5 min | |
后延伸 | 72℃ | 10min |
五、數據處理
12.設定60℃-96℃范圍的融解曲線分析,排除假陽性。
13.如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,再推算出其濃度。
14.如果把日本血吸蟲染料法熒光定量PCR試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長,有典型擴增曲線,Ct值應該小于或等于30。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。
關聯產品
幽門螺旋桿菌可視化LAMP檢測試劑盒