路鄧葡萄球菌染料法熒光定量PCR試劑盒在以往禽流感診斷中的應(yīng)用
*,雖然本次人感染豬流感事件的病毒基因序列還在進(jìn)一步確立當(dāng)中,但本次疫情病原學(xué)基礎(chǔ)明確,屬于RNA病毒感染性疾病。
回顧近年來感染RNA病毒的烈性傳染病,如SARS、禽流感,世界衛(wèi)生組織及我國衛(wèi)生行政和技術(shù)部門相繼制定了較為成熟的實驗室檢測和診斷標(biāo)準(zhǔn),其中我國頒布的應(yīng)用實時熒光定量PCR方法進(jìn)行實驗室檢測和快速診斷的標(biāo)準(zhǔn)如《GB/T 19438.1-2004禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法》、《GB/T 19438.2-2004 H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》、《GB/T 19438.3-2004 H7亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》等
。以上實時熒光定量PCR技術(shù)在禽流感檢測方面的國家標(biāo)準(zhǔn)是該技術(shù)在當(dāng)前的人感染豬流感診斷中應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提。
路鄧葡萄球菌染料法熒光定量PCR試劑盒及在我國衛(wèi)生應(yīng)急中的應(yīng)用要求
實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR,如果用于RNA檢測,這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實時PCR即Real-time RT-PCR)是實時PCR法,它是指對DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)的RNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并實時監(jiān)測DNA的放大過程,在擴(kuò)增的指數(shù)增長期就測量擴(kuò)增產(chǎn)物,因為擴(kuò)增指數(shù)增長期測量值與特異DNA(RNA)起始量存在相關(guān)性,從而實現(xiàn)定量檢測。
Real Time PCR的基本目標(biāo)是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸,從而可通過監(jiān)測CT值而實現(xiàn)對原始目標(biāo)基因的含量定量。目前被普遍使用的多種常規(guī)PCR方法如各種凝膠電泳PCR法,終點熒光定量法或PCR-ELISA法叫做終點PCR法。
實時熒光定量PCR法大的優(yōu)點是克服了終點PCR法進(jìn)入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差,實現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。
普通PCR技術(shù)發(fā)明于1983年,而實時熒光定量PCR技術(shù)發(fā)明于上世紀(jì)九十年代并于1996年生產(chǎn)出了世界上*臺實時熒光定量PCR儀,實時熒光定量PCR技術(shù)得以實現(xiàn)的技術(shù)要素主要有熒光定量PCR試劑盒和實時熒光定量PCR儀,我國熒光定量PCR試劑盒研發(fā)實力強(qiáng)大,生產(chǎn)廠家較多。
臨床診斷的品種如HBV/HCV及禽流感診斷試劑盒性能優(yōu)良、供應(yīng)充足,基本實現(xiàn)國產(chǎn)化。在豬流感病毒RNA核酸序列明確的情況下,利用現(xiàn)有的試劑研發(fā)平臺,人感染豬流感實時熒光定量PCR診斷試劑盒很快就會面世。
實時熒光定量PCR技術(shù)在豬流感診斷中的作用已有法規(guī)確立
在人感染豬流感病毒出現(xiàn)以前,針對豬與豬傳染的傳統(tǒng)豬流感疫情,近年來我國科技人員經(jīng)過不懈努力,探索快速檢測與診斷方法].
人感染豬流感疫情發(fā)生后,美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)于2009年4月28日發(fā)布了針對人感染豬流感病毒治療和預(yù)防臨時指南,其中規(guī)定了確診病例的診斷方法:具有急性發(fā)燒呼吸道疾病的臨床癥狀并且經(jīng)實時熒光定量PCR (real-time RT-PCR)或病毒分離培養(yǎng) (viral culture)實驗室檢測方法檢驗證實感染A(H1N1)型豬流感病毒。
衛(wèi)生部辦公廳于4月30日印發(fā)了《人感染豬流感預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)》的通知》[7],其中在實驗室檢測和病例診斷報告章節(jié),內(nèi)容如下:
檢測程序
呼吸道標(biāo)本應(yīng)首先應(yīng)用real time RT-PCR方法檢測A型流感病毒的M基因、Swine( H1N1)的HA基因和NP基因,以及質(zhì)控對照RNP基因。同時,接種MDCK細(xì)胞或SPF雞胚進(jìn)行病毒分離,并測定病毒的全基因組序列。
推薦檢測方法
用Real-time RT-PCR方法檢測豬流行性感冒( H1N1病毒)病毒。
其他檢測方法
快速流感抗原檢測
病毒培養(yǎng)
免疫熒光法(或裝配的IFA )
顯然,上述衛(wèi)生部法規(guī)中,與“其他檢測方法”不同,實時熒光定量PCR方法被法定為人感染豬流感診斷的推薦檢測方法。