念珠狀鏈桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒在以往禽流感診斷中的應(yīng)用
*,雖然本次人感染豬流感事件的病毒基因序列還在進(jìn)一步確立當(dāng)中,但本次疫情病原學(xué)基礎(chǔ)明確,屬于RNA病毒感染性疾病。
回顧近年來感染RNA病毒的烈性傳染病,如SARS、禽流感,世界衛(wèi)生組織及我國衛(wèi)生行政和技術(shù)部門相繼制定了較為成熟的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和診斷標(biāo)準(zhǔn),其中我國頒布的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和快速診斷的標(biāo)準(zhǔn)如《GB/T 19438.1-2004禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測(cè)方法》、《GB/T 19438.2-2004 H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》、《GB/T 19438.3-2004 H7亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》等
。以上實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在禽流感檢測(cè)方面的國家標(biāo)準(zhǔn)是該技術(shù)在當(dāng)前的人感染豬流感診斷中應(yīng)用的基礎(chǔ)和前提。
念珠狀鏈桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒及在我國衛(wèi)生應(yīng)急中的應(yīng)用要求
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR,如果用于RNA檢測(cè),這被稱為逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR即Real-time RT-PCR)是實(shí)時(shí)PCR法,它是指對(duì)DNA或經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)的RNA通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的放大過程,在擴(kuò)增的指數(shù)增長期就測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物,因?yàn)閿U(kuò)增指數(shù)增長期測(cè)量值與特異DNA(RNA)起始量存在相關(guān)性,從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
Real Time PCR的基本目標(biāo)是精確測(cè)量和鑒別非常微量的特異性核酸,從而可通過監(jiān)測(cè)CT值而實(shí)現(xiàn)對(duì)原始目標(biāo)基因的含量定量。目前被普遍使用的多種常規(guī)PCR方法如各種凝膠電泳PCR法,終點(diǎn)熒光定量法或PCR-ELISA法叫做終點(diǎn)PCR法。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR法大的優(yōu)點(diǎn)是克服了終點(diǎn)PCR法進(jìn)入平臺(tái)期或叫飽和期后定量的較大誤差,實(shí)現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。
普通PCR技術(shù)發(fā)明于1983年,而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)明于上世紀(jì)九十年代并于1996年生產(chǎn)出了世界上*臺(tái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)的技術(shù)要素主要有熒光定量PCR試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,我國熒光定量PCR試劑盒研發(fā)實(shí)力強(qiáng)大,生產(chǎn)廠家較多。
臨床診斷的品種如HBV/HCV及禽流感診斷試劑盒性能優(yōu)良、供應(yīng)充足,基本實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化。在豬流感病毒RNA核酸序列明確的情況下,利用現(xiàn)有的試劑研發(fā)平臺(tái),人感染豬流感實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷試劑盒很快就會(huì)面世。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在豬流感診斷中的作用已有法規(guī)確立
在人感染豬流感病毒出現(xiàn)以前,針對(duì)豬與豬傳染的傳統(tǒng)豬流感疫情,近年來我國科技人員經(jīng)過不懈努力,探索快速檢測(cè)與診斷方法].
人感染豬流感疫情發(fā)生后,美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)于2009年4月28日發(fā)布了針對(duì)人感染豬流感病毒治療和預(yù)防臨時(shí)指南,其中規(guī)定了確診病例的診斷方法:具有急性發(fā)燒呼吸道疾病的臨床癥狀并且經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time RT-PCR)或病毒分離培養(yǎng) (viral culture)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法檢驗(yàn)證實(shí)感染A(H1N1)型豬流感病毒。
衛(wèi)生部辦公廳于4月30日印發(fā)了《人感染豬流感預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)》的通知》[7],其中在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和病例診斷報(bào)告章節(jié),內(nèi)容如下:
檢測(cè)程序
呼吸道標(biāo)本應(yīng)首先應(yīng)用real time RT-PCR方法檢測(cè)A型流感病毒的M基因、Swine( H1N1)的HA基因和NP基因,以及質(zhì)控對(duì)照RNP基因。同時(shí),接種MDCK細(xì)胞或SPF雞胚進(jìn)行病毒分離,并測(cè)定病毒的全基因組序列。
推薦檢測(cè)方法
用Real-time RT-PCR方法檢測(cè)豬流行性感冒( H1N1病毒)病毒。
其他檢測(cè)方法
快速流感抗原檢測(cè)
病毒培養(yǎng)
免疫熒光法(或裝配的IFA )
顯然,上述衛(wèi)生部法規(guī)中,與“其他檢測(cè)方法”不同,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法被法定為人感染豬流感診斷的推薦檢測(cè)方法。