停乳鏈球菌染料法熒光定量PCR試劑盒在以往禽流感診斷中的應用

*，雖然本次人感染豬流感事件的病毒基因序列還在進一步確立當中，但本次疫情病原學基礎明確，屬于RNA病毒感染性疾病。

回顧近年來感染RNA病毒的烈性傳染病，如SARS、禽流感，世界衛生組織及我國衛生行政和技術部門相繼制定了較為成熟的實驗室檢測和診斷標準，其中我國頒布的應用實時熒光定量PCR方法進行實驗室檢測和快速診斷的標準如《GB/T 19438.1-2004禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測方法》、《GB/T 19438.2-2004 H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》、《GB/T 19438.3-2004 H7亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法》等

。以上實時熒光定量PCR技術在禽流感檢測方面的國家標準是該技術在當前的人感染豬流感診斷中應用的基礎和前提。

停乳鏈球菌染料法熒光定量PCR試劑盒及在我國衛生應急中的應用要求

實時熒光定量PCR技術（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡稱Real Time PCR,如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉錄實時PCR即Real-time RT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經過反轉錄（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監測DNA的放大過程，在擴增的指數增長期就測量擴增產物，因為擴增指數增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關性，從而實現定量檢測。

Real Time PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監測CT值而實現對原始目標基因的含量定量。目前被普遍使用的多種常規PCR方法如各種凝膠電泳PCR法，終點熒光定量法或PCR-ELISA法叫做終點PCR法。

實時熒光定量PCR法大的優點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現DNA/RNA的精確定量。

普通PCR技術發明于1983年，而實時熒光定量PCR技術發明于上世紀九十年代并于1996年生產出了世界上*臺實時熒光定量PCR儀，實時熒光定量PCR技術得以實現的技術要素主要有熒光定量PCR試劑盒和實時熒光定量PCR儀，我國熒光定量PCR試劑盒研發實力強大，生產廠家較多。

臨床診斷的品種如HBV/HCV及禽流感診斷試劑盒性能優良、供應充足，基本實現國產化。在豬流感病毒RNA核酸序列明確的情況下，利用現有的試劑研發平臺，人感染豬流感實時熒光定量PCR診斷試劑盒很快就會面世。

實時熒光定量PCR技術在豬流感診斷中的作用已有法規確立

在人感染豬流感病毒出現以前，針對豬與豬傳染的傳統豬流感疫情，近年來我國科技人員經過不懈努力，探索快速檢測與診斷方法].

人感染豬流感疫情發生后，美國疾病預防控制中心（CDC）于2009年4月28日發布了針對人感染豬流感病毒治療和預防臨時指南，其中規定了確診病例的診斷方法：具有急性發燒呼吸道疾病的臨床癥狀并且經實時熒光定量PCR （real-time RT-PCR）或病毒分離培養 （viral culture）實驗室檢測方法檢驗證實感染A（H1N1）型豬流感病毒。

衛生部辦公廳于4月30日印發了《人感染豬流感預防控制技術指南（試行）》的通知》[7],其中在實驗室檢測和病例診斷報告章節，內容如下：

檢測程序

呼吸道標本應首先應用real time RT-PCR方法檢測A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及質控對照RNP基因。同時，接種MDCK細胞或SPF雞胚進行病毒分離，并測定病毒的全基因組序列。

推薦檢測方法

用Real-time RT-PCR方法檢測豬流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。

其他檢測方法

快速流感抗原檢測

病毒培養

免疫熒光法（或裝配的IFA ）

顯然，上述衛生部法規中，與“其他檢測方法”不同，實時熒光定量PCR方法被法定為人感染豬流感診斷的推薦檢測方法。