河南專業科研細胞實驗技術服務石蠟切片/冰凍切片實驗-效勝實業
效勝實業河南專業科研細胞實驗技術服務石蠟切片/冰凍切片實驗
本公司開展了石蠟包埋、石蠟切片、冰凍切片、HE染色，massson染色，PAS染色等染色，免疫組化，免疫熒光，WB .PCR.透射電鏡，掃描電鏡，細胞培養等實驗服務服務介紹
1)技術原理:
石蠟切片（paraffin section）是組織學常規制片技術中為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態結構，也是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。活的細胞或組織多為無色透明，各種組織間和細胞內各種結構之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區別出；組織離開機體后很快就會死亡和產生組織，失去原有正常結構，因此，組織要經固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞組織死亡，而能清晰辨認其形態結構。
冰凍切片是指將組織在冷凍狀態下直接用切片機切片。它實際上是以水為包埋劑，將組織進行冰凍至堅硬后切片的。在冰凍切片前組織不經過任何化學藥品處理或加熱過程，大大縮短了制片時間。同時，由于此法不需要經過脫水、透明和浸蠟等步驟，因而較適合于脂肪、神經組織和一些組織化學的制片，并作為快速切片的方法應用在臨床診斷
2）特點：
石蠟切片標本可以*保存使用，為*性顯微玻片標本。
冰凍切片制作過程較石蠟切片快捷、簡便，而多應用于手術中的快速病理診斷．組織變化不大,能很好保存脂肪，類脂等成分。能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對于那些對有機溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細胞膜表面抗原和水解酶保存較好。
石蠟切片
（一）石蠟切片前的準備
1．切片刀。傳統的切片刀在使用之前，一定要在顯微鏡下檢查刀口的損傷程度，然后進行磨刀。現在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。
2．修整蠟塊：切去組織周圍過多的石蠟，一般情況下在組織周圍留有約1~2mm的石蠟邊，兩邊必須平行。
3．蠟塊固定：修整好的蠟塊先固定在事先準備好的小方木塊或者金屬塊上，固定方法是把蠟鏟先在酒精燈上加熱，再將蠟塊底部烙熔，迅速烙粘在小方木塊或金屬塊底座上。
4．載玻片擦洗干凈后，在其表面涂上粘附劑（蛋白甘油、APES或多聚賴氨酸），根據染色方法選擇不同的粘附劑。
5．準備好毛筆、鑷子、染色架。
6．調好展片器內水的溫度（45℃），有時也可以加些酒精到水中。
（二）石蠟切片
1．將切片刀裝在刀片機的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。
2．切片多使用輪轉式切片機，切片時，左手執毛筆，右手轉切片機轉輪，先修出組織塊。
3．調整切片機上的切片厚度為4~7μm，然后切片。
4．切片可以是單張，也可以是連續切片形成蠟帶
5．展片和撈片：
（1）直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待*展平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時擺正切片。
（2）溫水漂浮法：此法用展片機或者用恒溫水浴箱，先使水溫保持在45~50℃，用左手拿毛筆輕輕托起切片，用右手用*子夾起切片的一角，正面向上輕輕平鋪放置于展片器的水面上，動作要輕快，切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會自然平整地展開，必要時可用*輕輕拔開，然后撈片，并及時編號。
6．展好的切片在室溫下稍微干燥后，放在40℃恒溫烤箱中，小片組織30分鐘即可，大的需12~24小時，烤干備用。
（三）注意事項
1．切片刀刃傾斜過大或過小都不能正常進行切片。
2．修整蠟塊時要細心，看清楚組織在蠟塊中的位置，以免將需要的組織修掉。
3．連續轉動切片機的轉輪時，速度一定要均勻，不能時快時慢，以免切片厚薄不一。
4．使用輪轉式切片機切片時，是由下向上切，為得到定然整的切片，防止組織出現刀紋裂縫，應將組織硬、脆難切的部分放在上端，如皮膚應將表皮部分向上，腸胃等組織應將漿膜面面朝上。
5．用展片器展片時，水溫應根據使用的石蠟熔點進行了調整，一般低于石蠟熔點10~15℃；撈片的時候動作要輕、稍快。動作太大容易出現氣泡。如果沒有展片器可以用溫水浴鍋來代替。
6．單個切片要擺到載玻片的1/3與2/3交界處；連續切片的粘片順序一般是從左到右，組織切片較小是，可以并列粘貼2~3條蠟帶。
7．烤片的溫度不宜過高；烤片的時間要合適。腦組織要待稍微晾干一些后，才能烤片，否則容易產生氣泡影響染色和觀察。
冰凍切片
冰凍切片是指將組織在冷凍狀態下直接用切片機切片。它實際上是以水為包埋劑，將組織進行冰凍至堅硬后切片的。在冰凍切片前組織不經過任何化學藥品處理或加熱過程，大大縮短了制片時間。同時，由于此法不需要經過脫水、透明和浸蠟等步驟，因而較適合于脂肪、神經組織和一些組織化學的制片，并作為快速切片的方法應用在臨床診斷。
1. 取材： 應盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發生死后變化。
2. 速凍： 為了較好地保存細胞內的酶活性或盡快制成切片標本的需 要，一般在取材后就要立刻對組織塊進行速凍，使組織溫度驟降，縮短降溫的時間，減少冰晶的形成。 液氮速凍切片法是實驗室常用的速凍切片方法。具體做法是將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內，當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。在制成凍塊后，即可置入恒冷箱切片機冰凍切片。若需要保存，應快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存備用。
3．固定： 樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4℃冰箱預冷5-10min讓OCT膠浸透組織。 取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。 組織置于樣品托上，其上再添一層OCT膠，以*覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。
切片： 恒溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機，其基本結構是將切片機置于低溫密閉室內，故切片時不受外界溫度和環境影響，可連續切薄片至5-10μm。切片時，低溫室內溫度以-15℃～-20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。切好室溫放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。進行抗原熱修復，微波熱修復也可，室溫自然冷卻?？捎?%H2O2孵育5~10min，消除內源性過氧化物酶的活性。
5．免疫熒光染色：
冰凍切片室溫晾干15min,可用含10％正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1 小時（此步可不洗）
滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液(抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個過程中不會使組織干涸)，將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時或4℃過夜。
第二天先將濕盒放到37℃回溫1h，然后吸取片上的一抗進行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。
滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37℃孵育1 小時。 回收二抗，切片置于染缸內，PBS洗5min×3次。
滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min(工作濃度0.1%染色15min)。
回收DAPI,滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹膠，用處理干凈的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。做好的片放在切片盒內，置于4℃冰箱，可保存一周左右。
