雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒

 由于檢測光量子的方法非常敏感，采用生物發光（bioluminescent）法 ，是報告基因檢測常用的有效手段。熒光素酶（luciferase）催化底物熒光素（luciferin）的轉化，發射出光子。螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海腎熒光素酶（Ranilla luciferase）催化的發光反應，具有相似的光學特征和很好的濃度線性范圍（7~8個數量級的線性范圍），酶的檢測靈敏度達10-18~10-20 mol，但兩者催化的化學反應底物和適反應條件*不同。利用這一特性，將這兩種熒光素酶配合，即可形成十分有效的雙熒光素酶報告基因系統，其中Ranilla luciferase通常作為內參照。本試劑盒提供了一體化形式的雙熒光素酶檢測系統。采用通用裂解緩沖液，適合于兩種熒光素酶活性的保持，且與其他類型的報告基因檢測和蛋白含量檢測兼容。優化的兩種酶反應體系，使每種發光反應持續數十分鐘，以便于手工操作多個樣品，并保證Firefly luciferase發光及時淬滅，不影響后續Ranilla luciferase的測定。優化的反應體系還使兩種熒光素酶活性比值趨于合理的敏感范圍，更有利于后續數據的比較。該產品特點如下：
1. 準確性高：使用海腎熒光素酶作為內參照，減少了細胞數目、細胞健康狀態、轉染效率和非特異性細胞反應等因素的影響，使主報告基因的結果歸一化
2. 高度靈敏：對兩種熒光素酶的檢測靈敏度達10-18~10-20 mol
3. 線性范圍寬：線性范圍達到7~8個數量級
4. 快速簡便：一體化兩步法檢測，特別適合于高通量篩選
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA，有機層(黃色)主要為DNA和蛋白質。
實驗步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉錄合成cDNA;
3、PCR擴增;
4、產物的電泳和結果的測定。
RT-PCR是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進行。
堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會*分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
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