江蘇省尖底錐形過濾器
除菌過濾的目的是從原料藥液里通過過濾去除細菌。如果產品無法進行zui終滅菌，需要采用0.22mm（更小或相同過濾效力）的除菌過濾器進行除菌過濾。新版GMP附錄1“第十三章，非zui終滅菌產品的過濾”第九十一條規定，與其他滅菌方法相比，除菌過濾的風險zui大，因此，宜安裝第二只已滅菌的除菌過濾器再過濾一次藥液。圖一為除菌過濾工藝的工藝流程示意圖，澄清過濾一般采用深層濾芯，去除料液中的不純物質，降低料液濁度和生物負荷度。無菌過濾點采用預過濾與除菌過濾組合的方式確保除菌效率和濾芯過濾性能的穩定性。法規要求的*個要點是在采用除菌過濾方法時，首先確認采用的過濾器為“除菌級”，達到此要求后，除菌過濾法中的其它無菌保障措施才有意義。定義過濾器是否為除菌級，需要依靠過濾器的微生物截留能力，并完成相關的標準方法驗證和工藝驗證。目前業界缺乏統一標準來衡量孔徑，孔徑的標準對預測微生物截留和比較不同生產商生產的過濾器沒有實際的意義，因而，需要用微生物截留能力來定義除菌級過濾器（2010版-無菌制劑GMP實施指南）。以此可以看出細菌截留試驗對于除菌濾芯驗證的重要性。
細菌截留實驗準備
新版GMP實施指南中提到除菌級過濾器驗證的兩個主要因素：一是濾膜的級別，要求可適用的標準化試驗或類似的方法以細菌挑戰的方式進行；二是工藝驗證，由過濾器的使用者或指派的實驗設施（例如，過濾器的生產者或協議實驗室），使用有代表性的微生物進行挑戰，證明過濾器在生產條件下，可以*去除每個產品或產品家族中的微生物。應建立針對每個產品組的科學解釋并可能需要在實施驗證前經合適的監管機構審查。細菌截留實驗就可以*驗證過濾濾芯的細菌截留性能，也可以充分反映整個工藝環節對濾芯過濾性能的影響。因此，在截留試驗前必須做好如下準備：
過濾工藝評估：通過驗證服務調查問卷，客戶溝通甚至現場拜訪，需要*了解客戶工藝流程，包括溶劑性質（例如水基的、酸、堿、有機的）、過濾時間、工藝壓差、工藝流速、工藝溫度和過濾器設計規范，實驗室根據具體的情況，再結合過濾器本身的一些特性，模擬縮小化的工藝流程，這些流程需要與實際工藝流程相符或者更為惡劣，確保細菌截留實驗*按照或者更高于實際工藝制定。
細菌培養和篩選：細菌截留試驗采用缺陷假單胞菌（Brevundimonasdiminuta,ATCC19146），要求通過光學顯微鏡或者掃描電鏡觀察，直徑為0.3-0.4微米,長度為0.6-1.0微米，且呈單分散狀態，這些重要特性需每次進行觀察和篩選，以免對截留試驗造成影響。
江蘇省尖底錐形過濾器
根據ASTM838-83對除菌級濾芯的定義，用107CFU/cm2的缺陷性假單胞菌（ATCC19146）進行試驗，下游濾出液無菌。細菌挑戰試驗研究的目的就是通過實驗獲得文件證據，證明在模擬工藝條件下，過濾過程可以持續去除懸浮于產品或替代流體中的高水平的標準細菌或相關微生物污染分離物。
細菌截留試驗進行前，需要*行細菌存活性試驗，來了解客戶產品在模擬的工藝條件下對截留菌生長的影響，試想如果客戶產品在模擬工藝條件下，會對截留菌生長造成影響，甚至無法存活，那分析濾膜未發現截留菌，是產品對截留菌的影響造成還是測試濾膜過濾的緣故都無從而知，因此細菌存活性試驗是截留試驗的預實驗，可以為截留試驗提供重要的理論依據，以此來確定截留試驗的過程，是采用單步還是多步進行試驗。
細菌截留試驗測試過程中使用如圖4所示裝置，一共包括CTL1-4四套截留裝置，CTL1-3即為所要驗證濾芯的三個重復，CTL-4為整個實驗的對照組，其中TF1，2，3分別為不同批號的測試濾膜，為過濾精度為0.22微米或者0.2微米的除菌濾膜，且每個TF上下游都加裝壓力表，用于監控整個實驗過程中，測試濾膜兩端的壓力，TF4為對照，為過濾精度為0.45微米的濾膜，AF-1，2，3，4均為分析濾膜。實驗過程中將產品或者替代液配置成一定濃度的挑戰液，一般要求不低于107CFU/cm2，按照模擬的縮小化工藝條件，采用蠕動泵將其按照一定的速度通過測試和分析濾膜，在試驗過程中，需要在不同時間點，對壓力，流速，溫度等關鍵參數進行監控并記錄，且在細菌截留試驗開始前和結束后，對微生物進行平板菌落計數確定挑戰菌的濃度。
當截留試驗結束后，需要將分析濾膜放于平板上培養，如果上游的測試濾膜為除菌濾膜，即圖中的TF1，2，3，則下游即分析濾膜上不會發現截留菌生長，如果上游的測試濾膜為非除菌濾膜即TF-4，則下游即分析濾膜上會發現挑戰菌生長。根據分析濾膜上是否有挑戰菌生長進行判斷，對于對照CTL-4，因0.45微米濾膜對于挑戰菌濃度在104～106CFU/cm2時，無法達到除菌過濾的效果，所以對照組下游的分析濾膜，即AF-4必定會有挑戰菌的生長，這樣一則可以對挑戰菌進行鑒定，鑒定該挑戰菌的純度及形態特征，二則可以判斷挑戰液的濃度是否已經達到預期的濃度。
實驗結果與分析
細菌截留實驗結果包括細菌截留前后膜片完整性測試值，陰性對照結果，產品循環工藝參數和分析膜片結果四個部分。如表1記錄了實驗膜片完整性測試結果，從中可以對截留試驗前和后，濾膜的完整性數據進行評估，是否符合濾芯廠家對于該類濾芯的完整性要求。
表2陰性對照結果，需要確認在未接種截留菌前整個截留裝置是否保持無菌。表三為分析濾膜結果，也是決定細菌截留試驗成敗的關鍵指標，分為兩部分，*部分為截留菌的濃度，需按要求菌不低于107CFU/cm2，可以分析達到了ASTM-838對除菌級濾芯截留濃度的要求，另外一部分為分析濾膜的結果，對于TCL-1，2，3裝置中AF均未發現截留菌，說明TF可以恒定高效的去除挑戰液中的截留菌，對于對照組的TCL-4下游的AF4，則發現有截留菌生長，可以利用特定的鑒定試劑盒，對結果進行鑒定，確認下游所發現的細菌有且僅為我們的標準截留菌。
當陽性對照組平均含菌量在 5×`10^4` CFU/100 ML～5×`10^5` CFU/100 ML。陰性對照組均無菌生長時。在3次試驗所有流量段水樣中大腸桿菌下降至 0/100 ML 時，可判為實驗室試驗中飲水消毒效果合格。若陽性對照組和陰性對照組含菌量未達上述要求,應尋找原因,糾正后重做試驗。
關于消毒技術規范?生活飲用水消毒效果鑒定中飲水過濾器除菌試驗：
1）試驗分組
①試驗組。申請消毒產品衛生許可證時，按使用說明書規定的zui大流量,測定其對大腸桿菌的除菌效果。
②陽性對照組,以未經消毒的試驗菌污染水樣進行活菌培養計數;
③陰性對照組,以試驗所用同批次未經使用的培養基進行培養,觀察有無細菌生長。
2）操作程序
①配制試驗菌污染水樣。
②取 2 份試驗菌污染水樣,進行大腸桿菌活菌計數(陽性對照組)。
③按過濾器產品規定的zui大流量,將試驗菌污染水樣分段通過飲水過濾除菌裝置。按規定過濾的水量,用無菌三角瓶分段采集:初始、1/4、2/4、3/4、4/4 等各段流出的水樣(不需加中和劑)。
④對過濾后各段水樣,分別取 100ML、10ML、1ML各 2 份,進行大腸桿菌活菌培養計數。
⑤將未接種大腸桿菌的試驗用同批培養基平板 2 個,置培養箱中培養(陰性對照組)。
⑥試驗重復 3 次。
