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免疫印跡Western Blot實驗代測
免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA 結合蛋白和其相關的DNA 結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術zui初用于研究DNA 結合蛋白，目前已用于研究RNA 結合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。
| Western blot 檢測 | 1400元/膜 | 每張膜1--8樣本 |
| EMSA | 2800元/膜 | 每張膜1--8樣本，包括探針及試劑 |
上海信帆代做實驗項目:ELISA,免疫組化,免疫印跡Western Blot,放射免疫,實時熒光定量ＰＣＲ,，免疫組織，特殊染色,病理學檢測技術服務等等!我們擁有的實驗室,客戶檢測項目均提供實驗室儀器型號,提供操作詳細步驟.歡迎!
Western Blot實驗
成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：
凝膠洗脫：轉移期間蛋白質必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質還截留在凝膠中，將無法在膜上進行分析
吸附到膜上：在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進行分析
處理期間仍截留在膜上：在轉移后的處理過程中蛋白質必須保持吸附在印跡膜上
處理過程中可接近：被吸附的蛋白質必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質被掩蓋則無法檢測
成功進行WB檢測，則設置合適正確的對照是*的，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到WB的問題所在，并保證實驗結果的準確性和特異性！一般需要設置的對照如下：
陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率
陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用于檢測抗體的特異性
二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性
內參對照：檢測標本的質量和二抗系統
空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質和封閉的效果
WB 檢測基本過程
1 、獲取細胞或組織裂解物
1)根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
| 蛋白位置 | buffer |
| 全細胞 | NP-40 or RIPA |
| 胞漿（可溶性蛋白） | Tris-HCl |
| 胞漿（骨架結合蛋白） | Tris-Triton |
| 膜蛋白 | NP-40 or RIPA |
| 核蛋白 | RIPA or 核蛋白提取試劑盒 |
| 線粒體蛋白 | RIPA or 線粒體分離試劑盒 |
亦可購買商業化的蛋白提取試劑盒來保證標本制備的質量
2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性！
2 、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據情況將標本保存在-20°C /-80°C備用，進行免疫沉淀（IP）或者直接進行電泳分離蛋白
3 、電泳分離蛋白質
根據待測蛋白狀態確定電泳條件：
| 待測蛋白狀態 | 凝膠條件 | 上樣buffer | 電泳buffer |
| Reduced - Denatured | 還原，變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Reduced - Native | 還原，不變性 | 含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
| Oxidized - Denatured | 不還原，變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS | 含SDS |
| Oxidized - Native | 不還原，不變性 | 不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS | 不含SDS |
根據待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
| 蛋白分子量（kDa） | 凝膠濃度（％） |
| 4-40 | 20 |
| 12-45 | 15 |
| 10-70 | 12.5 |
| 15-100 | 10 |
| 25-200 | 8 |
4 、轉膜
根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術參數及比較如下：
| | PVDF膜 | NC膜 | 尼龍膜 |
| 靈敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
| 背景 | 低 | 低 | 較高 |
| 蛋白結合能力 | 100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結合） | 80-100ug/cm2 | >400ug/cm2 |
| 機械強度 | 強 | 干的膜易脆 | 軟而結實 |
| 溶劑抗性 | 強 | 差 | 差 |
| 使用前是否需要浸潤 | 100%甲醛潤濕 | 緩沖液潤濕 | 緩沖液潤濕 |
| 適用染色方法 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭 | 膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁 | 不能用陰離子染料 |
| 適用檢測方法 | 顯色法、化學發光、熒光、放射性、化學熒光、快速免疫檢測 | 顯色法、化學發光、熒光、放射性 | 顯色、化學發光、放射性 |
| 適用范圍 | 普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質測序、氨基酸分析、重復檢測 | 普通蛋白WB、氨基酸分析、重復檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白 | 低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用 |
| 價格 | 高 | 較低 | 低 |
5 、封閉
去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6 、一抗孵育
一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：
選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）
選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）
選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體
免疫印跡Western Blot實驗代測
一抗的保存和使用：
根據說明書的要求條件進行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復凍融。
抗體的工作液現配現用，在4度保存不要超過2周
根據說明書濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書的稀釋比例只作參考，需要在說明書的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索稀釋度（1:100-1:3000）。
孵育條件：4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據抗體親和力不同孵育時間有所區別
內參的選擇和使用：WB 過程監測以及目的蛋白定量的標準！
WB常用內參及其技術參數：
| 內參名稱 | 分子量大小 | 適用范圍 |
| beta-actin | 43kDa | 胞漿和全細胞 |
| GAPDH | 30-40kDa | 胞漿和全細胞 |
| Tubulin | 55kDa | 胞漿和全細胞 |
| VCDA1/Porin | 31kDa | 線粒體 |
| COXIV | 16kDa | 線粒體 |
| TBP | 38kDa | 細胞核 |
詳情請參考
7 、二抗孵育
根據說明書濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時
8 、底物孵育
選擇顯色或者化學發光底物。一般傾向于化學發光，靈敏度高且背景低，節省抗體用量
9 、結果分析和檢測
凝膠成像系統檢測或者暗室曝光到膠片
注意事項
1、 抗體：事先咨詢信帆生物，明確抗體種屬及指標名稱，確定我司抗體庫否有該抗體可使用，如有一抗可免費提供，如無可由雙方協商而定，客戶自己購買提供或我公司代購；
2、 標本收集與保存：
組織樣品 新鮮組織放入液氮或-70度保存，組織不少于100mg（約綠豆大小）；
培養細胞 通過細胞計數取不少于100萬個細胞于EP管，加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，混勻后保存于冰箱（-70℃，避免反復凍融）；
血液細胞標本 以抗凝管保存血樣或以淋巴細胞分離液分離細胞后加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護劑，保存（-70℃可保存，避免反復凍融）
血清或細胞培養液標本 離心去掉雜質后取上清入EP管，保存（以上4℃可保存15-20天，-70℃可保存，避免反復凍融）
3 、 樣本運輸：可選以下任何的一種方式寄送標本
組織樣本、細胞樣本以干冰運輸或加入蛋白保護劑后加冰袋運輸；
細胞樣本也可以直接快件寄送培養瓶（密封保證不污染，培養液不漏出，細胞不要長得太滿，50%左右，灌滿培養液）；
血清或上清液直接加冰袋寄送（密封保證液體不漏出，視路途遠近2-3天可到達）。
流程：
1、客戶告知實驗分組、編號、檢測樣本類型、種屬、指標，有具體要求請事先說明；
2、簽訂合同，寄送樣本和抗體，如需我方提供抗體請事先說明；
3、客戶支付預付款，進行實驗。
4、提供原始數據，分析數據，實驗室儀器型號，所用試劑品牌貨號，圖片，實驗報告等！
