AtT-20細胞,小鼠垂體瘤細胞特性:
1、細胞活力
原代取材活力≥90
產(chǎn)品復(fù)蘇率≥60
培養(yǎng)兩天就能清晰看到軸突與樹突,培養(yǎng)時間可長達13-16天。
2、細胞純度
80以上細胞神經(jīng)元細胞標記物為陽性
質(zhì)量控制:本產(chǎn)品經(jīng)過了細菌、真菌、霉菌、病毒(HIV、HBV、HCV)、支原體檢測。
運輸保存:采用干冰保存運輸
用途:只可用于科研,不可用于臨床診斷和治療
細胞生長:貼壁生長,在軟瓊脂中成簇生長,并可懸浮生長
細胞檢測:細胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌
AtT-20細胞,小鼠垂體瘤關(guān)于細胞培養(yǎng)溫馨小貼士:
細胞的凍存方法
1.細胞:選對數(shù)生*細胞,收集細胞24小時前換液一次。
2.計數(shù):按常規(guī)方法把細胞制成細胞懸液,計數(shù),令細胞密度達5×106/ml,離心去上清,吸入離心管中。
3.凍存液:先用培養(yǎng)液9分+DMSO 1分(或甘油)配成10%的DMSO凍存液,按上法一滴滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。
4.分裝:分裝入無菌安剖中,每安剖加1.5毫升細胞懸液。
5.封口:用塑料安剖時擰緊瓶口即可;如用火焰封閉安剖口后,仔細檢查,定要封嚴,必要時可浸入藍色液中觀察,為安全起見,把安剖縫入紗布小袋中,以防液氮浸入后,融解時因受熱發(fā)生爆炸傷人;紗袋一端系以線繩,末端扎有小牌,注明:細胞名稱,凍存日期,以便日后查找。
細胞復(fù)蘇的方法
1.從液氮罐中取出安剖;有時因安剖未封嚴,浸入了液氮,取出后因安剖內(nèi)液氮迅速氣化而發(fā)生爆炸,因此應(yīng)帶有防護眼睛和手套。
2.迅速放入盛有36℃~37℃水的搪瓷罐中,扣上蓋并不時搖動,盡快解凍。
3.剪開紗布口袋,取出安剖,用70%酒精擦拭消毒后,凈化臺上打開蓋,用吸管吸出細胞懸液,裝入離心管中,再補加10ml培養(yǎng)液,吹打使細胞懸浮。
4.低速離心(500~1000轉(zhuǎn)/分)5分鐘,取上清后再重復(fù)用培養(yǎng)液漂洗、離心。
5.加入培養(yǎng)液適當稀釋后,再移裝入培養(yǎng)瓶中,置溫箱培養(yǎng),次日更換一次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)。
污染的預(yù)防和清除
一、污染的預(yù)防
預(yù)防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法。只有預(yù)防工作做在前,才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手:
(一)從操作者做起
1、操作者責(zé)任心要強,要細心穩(wěn)重,操作技術(shù)要熟練。進無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘,按規(guī)定穿*。進入后關(guān)好門,坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物,不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi),更不能隨便使用,以免造成大批污染。
2、操作者動作要輕,必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話,若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。
3、操作時要常更換吸管,切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實驗完畢及時收拾,保持實驗室清潔整齊,zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。
(二)從物品、用品消毒滅菌著手細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*,各種溶液滅菌除菌要仔細,并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。
(三)防止細胞交叉污染
在進行多種細胞培養(yǎng)操作時,所用器具要嚴格區(qū)分,做上標記便于辨別。并按順序進行操作,避免一起進行時易發(fā)生混亂。在進行換液或傳代操作時,注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口,以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。所有細胞一旦購置,或從別處引入,或自己建立,均應(yīng)及早留種凍存,一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇,重新培養(yǎng)。
二、污染的清除
培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染,多數(shù)較難處理。如果污染細胞價值不大,宜棄之;有細胞株留存的或可購置的,可在尋找原因后*消毒操作室,復(fù)蘇或重新購置細胞,再培養(yǎng)。若污染細胞價值較大,又難于重新得到,可采取以下辦法清除。
(一)使用抗生素
抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素(*100u/mL加*100μg/mL),污染后清除用藥需采用大于常用量5~10倍的沖洗法,于加藥后作用24~48小時,再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除*、*外,還可用*、*、多粘菌素、四環(huán)素、*等。常用400~800μg/mL*或200μg/mL四環(huán)素處理,每隔2~3日換液1次,傳1~2代進行治療。近年來有報道,4-氟,2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250X濃縮液,-20℃保存?zhèn)溆茫褂脻舛菴ip為10μg/mL,BM-1為10μg/mL,BM-2為5μg/mL。使用時先吸除污染的培養(yǎng)液,加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液,3天后再吸除培養(yǎng)液,加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)4天,如此連續(xù)3個輪次,直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后,再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。
(二)使用支原體特異性血清
用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價1:320以上)可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長,故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性,并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩,不如用抗生素方便、經(jīng)濟。
(三)加溫處理
將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時,可殺死支原體,但對細胞有不良影響。所以在處理前要進行預(yù)試驗,摸索能zui大限度殺死支原體又對細胞影響zui小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后,再以41℃加溫處理效果更佳。
(四)其他方法
除了上述去除污染的方法外,還有動物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴*再用光照射的方法及過濾法等,但均較麻煩,且效果不確定。所以一旦支原體污染,除非有特別重要價值,一般均棄之重新培養(yǎng)。
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