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Ex?(nm)	468	Em?(nm)	493
分子量	793.99	溶劑	DMSO
儲存條件	在零下15度以下保存,?避免光照

產品參數(shù)

Ex (nm)	468	Em (nm)	493
分子量	793.99	溶劑	DMSO
存儲條件	在零下15度以下保存, 避免光照

產品概述

AAT Bioquest的iFluor 460琥珀酰亞胺酯染料 針對標記蛋白質（特別是抗體）進行了優(yōu)化。這些染料是明亮的，耐光的，并且對蛋白質的淬滅作用小。盡管在許多新型熒光儀器中都安裝了460 nm藍光二極管激光器，但很少有染料可以在460 nm處被很好地激發(fā)。iFluor 460經(jīng)過優(yōu)化，可以被460 nm的藍光二極管激光器很好地激發(fā)，從而為配備460 nm藍光二極管激光器的新型熒光儀器實現(xiàn)了新的生物學應用。iFluor 460 SE相當穩(wěn)定，并且對蛋白質氨基具有良好的反應性和選擇性。百螢生物為您提供優(yōu)質的iFluor 460琥珀酰亞胺酯染料 。

實驗方案

樣品分析方案

儲備溶液配制

1.蛋白質儲備液（溶液A）

將100 µL反應緩沖液（例如1 M碳酸鈉溶液或pH值為9.0的1 M磷酸鹽緩沖液）與900 µL目標蛋白溶液（例如抗體，如果可能，蛋白濃度> 2 mg / mL）混合，得到1 mL蛋白質標記儲備液。
注意：蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。如果蛋白質溶液的pH值低于8.0，請使用1 M碳suan氫鈉溶液或1 M pH 9.0磷酸鹽緩沖液將pH值調整為8.0-9.0。
注意：蛋白質應溶于pH 7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中。如果將蛋白質溶解在Tris或甘安酸緩沖液中，則必須使用pH 7.2-7.4的1X PBS進行透析，以去除用于蛋白質沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和乙酸銨）。
注意：如果蛋白質濃度低于2 mg / mL，結合效率會大大降低。為了獲得標記效率，建議蛋白質濃度范圍為2-10 mg / mL。

2.染料原液（溶液B）
將無水DMSO加入iFluor™460 SE小瓶中，制成10-20 mM儲備液。通過輕柔移液或渦旋混合均勻。
注意：開始綴合之前，請準備染料儲備溶液（溶液B）立即使用。染料儲備溶液的長時間儲存可能會降低染料活性，避免凍融循環(huán)。
注意：收到后，iFluor™染料應儲存在<-15°C的環(huán)境中，并遠離光線和濕氣。
注意：重新配制的iFluor™染料SE的DMSO儲備溶液可以在<-15°C下保存長達4周。
注意：所需的蛋白質綴合物應在載體蛋白質（例如0.1％牛血清白蛋白）存在的情況下以> 0.5 mg / mL的濃度保存。當在2 mM疊dan化鈉存在下存儲時，綴合物溶液可以在4°C下存儲兩個月而無明顯變化。為了更長的存儲時間，可以將蛋白綴合物凍干或分成單份使用，并保存在≤-60°C下，并避光。

操作步驟

該標記方案是針對山羊抗小鼠IgG與iFluor™460 SE的綴合物而開發(fā)的，供參考。您的實際情況可能需要進一步優(yōu)化您的特定蛋白質。

確定的染料/蛋白質比率（可選）

每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比率，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能會不利地影響其結合親和力，而低染料/蛋白質比率的蛋白質綴合物會降低靈敏度。我們建議您使用一系列不同量的標記染料溶液，通過實驗確定的染料/蛋白質比率。通常，大多數(shù)染料-蛋白質綴合物推薦使用4-6種染料/蛋白質。

以溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的10：1摩爾比為起點：將5 µL染料儲備溶液（溶液B，假定染料儲備溶液為10 mM）添加到蛋白質瓶中。溶液（95 µL溶液A）有效搖動。假設蛋白質濃度為10 mg / mL，蛋白質的分子量為?200KD，則蛋白質的濃度約為0.05 mM。
注意：蛋白質溶液中DMSO的濃度應小于10％。
進行綴合反應。
重復步驟2，溶液B /溶液A的摩爾比為5：1；15：1和20：1。
使用預制的旋轉柱純化所需的綴合物。
計算上述4種綴合物的染料/蛋白質比率（DOS）。
對以上4種綴合物進行檢測，以確定的染料/蛋白質比率，以擴大標記反應的范圍。

進行綴合反應

在有效搖動下，將適量的染料儲備溶液（溶液B）添加到蛋白質溶液（溶液A）的小瓶中。
注意：溶液B /溶液的摩爾比由上述步驟確定。如果跳過該步驟（本節(jié)：確定的染料/蛋白質比），我們建議使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比為10：1。
在室溫下繼續(xù)旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

純化

以下方案是使用Sephadex G-25色譜柱純化染料-蛋白質綴合物的示例。

準備Sephadex G-25色譜柱。
將反應混合物（步驟的一步：進行綴合反應后的混合物）加載到Sephadex G-25色譜柱的頂部。
樣品剛好在頂部表面下方流動時，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。
向所需樣品中添加更多PBS（pH 7.2-7.4），以完成柱純化。
注意：為了立即使用，染料-蛋白質偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝多次使用。
注意：為了長期保存，染料-蛋白質結合物溶液需要濃縮或冷凍干燥（見下文）。

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