操作步驟

1.準(zhǔn)備細(xì)胞：

1.1對(duì)于貼壁細(xì)胞：在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中將細(xì)胞以40,000至80,000個(gè)細(xì)胞/孔/100μL在96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，或?qū)τ?84孔板以10,000至20,000個(gè)細(xì)胞/孔/25μL。

1.2對(duì)于非粘附細(xì)胞：從培養(yǎng)基中離心細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀懸浮于等量的HHBS和MP染料加載溶液（參見(jiàn)下面的步驟2.2），125,000至250,000細(xì)胞/孔/100μL，96-以及聚賴(lài)氨酸d板或30,000至60,000個(gè)細(xì)胞/孔/25μL的用于384孔聚賴(lài)氨酸d板。在實(shí)驗(yàn)之前，在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下以800rpm 離心板2分鐘。

注意：每個(gè)細(xì)胞系應(yīng)在個(gè)人基礎(chǔ)上進(jìn)行評(píng)估，以確定佳的細(xì)胞密度為細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員。

2.準(zhǔn)備DiSBAC2（3）染料加載溶液（1板）：

2.1在高質(zhì)量無(wú)水DMSO中制備10至30 mM的DiSBAC2（3）原液。應(yīng)及時(shí)使用原液; 任何剩余的溶液需要被等分并冷凍在< -20 ? C.

注意：避免反復(fù)凍融循環(huán)，避免光照。

2.2制備2X DiSBAC2（3）染料加載 溶液： 在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將DiSBAC2（3） 固體溶解在DMSO中或?qū)⒌确衷嚇拥腄iSBAC2（3）儲(chǔ)備溶液解凍至室溫。用0.04％的制備的在Hanks（HHBS）20至40μM和20mM Hepes緩沖液或者緩沖您的選擇，pH為7的2X工作溶液到0.08％的Pluronic ® F-127（目錄＃20053）和2mM 錐蟲(chóng)紅Plus（Cat＃2456）。通過(guò)votexing很好地混合它們。該工作溶液在室溫下穩(wěn)定至少2小時(shí)。

3.運(yùn)行膜電位測(cè)定：

3.1將100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）DiSBAC2（3）染料加載溶液（來(lái)自步驟2.2）加入細(xì)胞板中。

注1：如果您的篩選化合物干擾g rowth培養(yǎng)基和血清因子，在添加DiSBAC2（3）染料加載 溶液之前，用等體積的HHBS緩沖液替換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。或者，細(xì)胞可以在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)。

注2：染料加載后不要洗滌細(xì)胞。

3.2將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30至60分鐘。

注意：在病例中，在室溫下孵育30至60分鐘可能會(huì)更好。

3.3使用HHBS或所需的緩沖液制備復(fù)合板。

3.4通過(guò)監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強(qiáng)度（Cat＃21414）進(jìn)行膜電位測(cè)定。

注意：在實(shí)驗(yàn)之前運(yùn)行信號(hào)測(cè)試很重要。不同的儀器有自己的強(qiáng)度范圍。將信號(hào)測(cè)試強(qiáng)度調(diào)整到大儀器強(qiáng)度計(jì)數(shù)的10％至15％的水平。例如，F(xiàn)LIPR-384的大熒光強(qiáng)度計(jì)數(shù)為65,000，因此應(yīng)調(diào)整儀器設(shè)置以使其信號(hào)測(cè)試強(qiáng)度在7,000到10,000左右。